IL-1Ra和IL-10真核表达质粒载体的构建及其表达检测

目的:构建人IL-1Ra和人IL-10真核表达质粒载体并检测其表达。方法:用双酶切方法切取PCDI-IL-1Ra和PCDI-IL-10质粒中包含人IL-1Ra和人IL-10 CDS全长序列的cD-NA片段,并分别连接到真核表达质粒pcDNA3.1上,然后用壳聚糖转染上述质粒到原代软骨细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达。结果:成功将人IL-1Ra和IL-10 CDS全长序列的cDNA片段克隆到真核表达载体,mRNA水平检测到目的基因的表达明显提高。结论:真核表达质粒可以用于外源基因的原代软骨细胞导入和表达,为进一步的基因治疗研究提供依据。     

外治法对固定关节组织形态修复的作用

目的：观察外治法对固定关节组织形态修复的作用，从形态学方面了解其作用机制。方法：将Waster大鼠24只，随机抽签法分4组，其中A，B，C组为试验组，均将左后膝关节于屈曲100&;#176;固定4周，D组为空白对照组。A组固定4周后处死，迅速取固定侧胫骨平台处关节软骨；B，C组于实验开始4周后解除固定，B组笼中自由活动4周，C组则采用外用中药合并推拿治疗4周，3组一起处死，组织取材同前，常规处理，苏木精-伊红(HE)染色和Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原蛋白免疫组化标记。结果：光镜观察显示HE染色显示软骨细胞排列不规则。有簇聚现象；胶原纤维排列紊乱。A，B组免疫组化发现Ⅱ型胶原纤维排列紊乱，有大量Ⅰ型和Ⅲ型胶原存在。C组Ⅱ型胶原与D组相近，Ⅰ型和Ⅲ型胶原显示极少。     

神经营养因子基因修饰的神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用

中枢神经系统损伤后的再生修复一直是神经科学领域的前沿研究课题。其中脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)无论是在发生率、还是在给患者造成的痛苦和社会负担方面来说,都使其成为该领域的研究重点。但是长期以来SCI缺乏有效治疗手段,因此探索SCI后的再生修复,使截瘫患者站起来,成为骨科和神经科医生最关注的问题之一。     

胶质细胞源性神经营养因子和肿瘤坏死因子可溶性受体基因修饰的神经干细胞联合移植治疗脊髓损伤的实验研究

目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和肿瘤坏死因子可溶性受体（sTNFR）腺病毒感染的人神经干细胞移植治疗脊髓损伤模型的可行性。方法先包装和扩增含GDNF和sTNFR基因的重组腺病毒，然后用该腺病毒感染人神经干细胞，再将这些神经干细胞移植到脊髓损伤局部。实验动物与分组：雄性sD大鼠，A组：hGDNF和sTNFR转基因神经干细胞移植组；B组：空病毒转基因神经干细胞移植组；c组：神经干细胞移植组；D组：只横断脊髓，不作移植；E组：对照组，只咬除棘突和椎板，不横断脊髓，不做其他处理；F组：不作任何处理。免疫组化检测外源基因的局部表达，最后进行组织学检查和BBB功能评分。结果免疫组化显示局部有外源基因表达，A组BBB功能评分优于C组，但组织学结果未见明显优势；这两组BBB评分显著优于阴性对照组，组织形态也有明显改善。结论腺病毒介导的GDNF和sTNFR基因修饰的神经干细胞移植是一种较好的脊髓损伤治疗方法。     

壳聚糖载体介导的骨关节炎基因治疗

目的:探讨由壳聚糖载体介导的骨性关节炎的基因治疗。方法:分别制备壳聚糖pcD-NA3.1-IL-1Ra和壳聚糖pcDNA3.1-IL-10纳米粒复合物,采用该复合物转染体外培养的正常原代兔关节软骨细胞,并将其作为药物直接注射进骨关节炎模型兔关节腔内。分别采用RT-PCR、ELISA和免疫组化方法从mRNA水平和蛋白水平检测目的基因的转染情况,并对治疗后实验动物的关节软骨和滑膜进行大体组织学观察。结果:正常原代软骨细胞转染后,在mRNA水平上检测到外源基因的水平升高;体内转染后,在蛋白水平上检测到目的蛋白在关节软骨内有阳性染色,且经基因治疗的兔关节软骨的破坏程度明显轻于未经基因治疗的对照组。结论:壳聚糖是一种较理想的基因载体,可用于早期骨性关节炎的基因治疗。     

外治法对固定关节组织形态修复的作用

目的:观察外治法对固定关节组织形态修复的作用,从形态学方面了解其作用机制。方法:将Waster大鼠24只,随机抽签法分4组,其中A,B,C组为试验组,均将左后膝关节于屈曲100°固定4周,D组为空白对照组。A组固定4周后处死,迅速取固定侧胫骨平台处关节软骨;B,C组于实验开始4周后解除固定,B组笼中自由活动4周,C组则采用外用中药合并推拿治疗4周,3组一起处死,组织取材同前,常规处理,苏木精-伊红(HE)染色和Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原蛋白免疫组化标记。结果:光镜观察显示HE染色显示软骨细胞排列不规则,有簇聚现象;胶原纤维排列紊乱。A,B组免疫组化发现Ⅱ型胶原纤维排列紊乱,有大量Ⅰ型和Ⅲ型胶原存在。C组Ⅱ型胶原与D组相近,Ⅰ型和Ⅲ型胶原显示极少。结论:外用中药和推拿对固定造成的关节软骨损害具有肯定疗效。     

人体骨-髌腱-骨及半月板移植物浸提液的细胞毒性研究

目的:探讨ACL重建及半月板修复所用异体移植物的组织安全性。方法:分别以不同浓度梯度人体骨-髌腱-骨和半月板移植物浸提液培养NIH3T3细胞,光镜下观察细胞形态,MTT法检测受试物中存活细胞百分比,其结果与DMEM培养液(阴性对照组)及苯酚(阳性对照组)中存活细胞百分比进行比较。结果:光镜下各种浓度移植物浸提液培养的细胞形态均正常,存活率均大于97%,明显优于阳性对照组。结论:本实验中人体骨-髌腱-骨和半月板移植物未见细胞毒性。     

人GDNF基因的腺病毒载体构建及其在人神经干细胞中的表达

目的：观察构建的含人胶质细胞源性生长因子（GDNF）基因腺病毒载体对人神经干细胞的感染及其基因表达情况,为脊髓损伤的基因及神经干细胞治疗提供前期实验依据。方法：从12周龄流产人新鲜胚胎中提取人神经干细胞并进行培养,行Nestin免疫荧光染色进行检验。将全长558bp编码人GDNF的cDNA克隆到重组腺病毒载体质粒,并在人胚肾细胞（HEK293细胞）中包装出含有目的基因hGDNF的腺病毒,然后用该腺病毒感染人神经干细胞,应用荧光显微镜和Western-blot检测病毒感染及外源基因的表达情况,并进行GFAP和Tubulin免疫荧光染色检测神经干细胞向神经细胞分化情况。结果：Nestin免疫荧光染色显示所培养细胞为阳性染色红色,表明其具有神经干细胞性状;感染48h后观察到神经干细胞中有大量的增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达,以及hGDNF蛋白高表达;感染后的神经干细胞有长的伪足伸出,呈GFAP和Tubulin染色阳性,表明促进了神经干细胞向神经元的分化。结论：腺病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可作为一种良好的基因导入载体,实现外源基因hGDNF在神经干细胞内的有效表达,并可为神经干细胞分化为神经元提供更有利条件。