低温海水浸泡对大鼠血浆蛋白质组的影响研究

目的模拟海难落水所致重度低体温损伤,比较鉴定低温海水浸泡模型动物血浆蛋白质组差异,为研究低体温相关血浆蛋白提供线索。方法将50只雄性健康Wistar大鼠平均分成5组,分别在低温海水中浸泡0、2、4、6、10 h后采集下腔静脉血。分离血浆后,用试剂盒去除Ig G和白蛋白等高丰度蛋白,并经过除盐后采用蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)分离。对差异1.5倍以上的蛋白斑点,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹图谱分析,应用NCBI或Swiss-prot数据库鉴定差异蛋白质。结果大鼠浸泡在15℃海水中,中心体温(肛温)迅速下降,浸泡30 min降至19℃,浸泡120 min降至16℃左右,体温维持不变,说明进入重度低体温状态。初步鉴定出3个与低温相关差异蛋白,肺表面相关蛋白A(SP-A)、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K(SPA3K)和抑制物组织基质金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3)。与正常大鼠相比,这3个蛋白的表达水平均随着低温海水浸泡时间的延长明显上调。结论低温海水浸泡后的大鼠血浆蛋白质组相对正常大鼠血浆蛋白质组有改变。研究差异蛋白有助于阐明低温损伤的分子机制,为研究和治疗低体温症提供靶标。     

地西他滨对K562/A02细胞阿霉素耐药性的影响

 目的: 观察地西他滨(DAC)对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02阿霉素(ADR)耐药性的影响,探讨其作用的可能机制。方法: 分别或联合应用不同浓度ADR和DAC作用于K562/A02细胞和其亲本细胞株K562,采用CCK-8法检测药物细胞毒性,Sequenom MassARRAY系统结合比色法评价DNA甲基化程度,流式细胞术检测K562/A02细胞细胞周期分布和细胞凋亡率。结果: K562/A02细胞较K562细胞具有显著ADR耐药性,前者ADR作用24 h的IC₅₀约为后者的50倍。而对DAC,在0.5~8 μmol/L作用浓度范围内,K562/A02细胞则较K562细胞更敏感。在相同ADR作用浓度(4.31和17.24 μmol/L)下,联合1 μmol/L DAC处理24 h能显著提高K562/A02细胞对ADR的敏感性,细胞存活率下降(P<0.05)。DAC和ADR均能影响K562/A02细胞的细胞周期进程和细胞凋亡率。1 μmol/L DAC的影响与作用时间相关,在作用24 h时以S期阻滞与细胞早期凋亡率升高为主,48 h时以G₂/M期阻滞与细胞晚期凋亡和坏死率升高为主。ADR则主要表现为浓度依赖性G₂/M期阻滞并诱导细胞晚期凋亡和坏死。两者联用使ADR对细胞周期分布的作用进一步加强,即表现为G₂/M期阻滞更加明显,但对细胞凋亡率的影响并无显著差异。而在基因组甲基化程度上,2种细胞没有显著差异,DAC作用前后也没有显著改变。结论: DAC能增强K562/A02细胞对ADR的敏感性,具有逆转耐药作用,其机制可能与调节K562/A02细胞细胞周期进程、促进细胞凋亡和坏死有关。     

负性富集食管鳞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的检测及其意义

目的:负性富集并鉴定食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)的数量及表型特征,探讨CTCs在食管鳞癌临床疗效评价和预后判断等方面的应用价值.方法:通过免疫磁珠偶联CD45抗体除去外周血白细胞,富集外周血CTCs的“负性策略”,用荧光鉴定CTCs上皮标志及细胞核特征,用统计学方法分析CTCs数量改变与患者临床参数与治疗效果、预后的相关性.结果:59例食管鳞癌患者术前外周血CTCs的阳性率为79.7％ (47/59),7.5ml外周血CTCs平均检出数目为7.83(0～ 72)个.其中淋巴结是否转移、肿瘤TNM分期、肿瘤浸润程度和分化程度、不同各组CTCs检出的差异,具有统计学意义(P＜0.05).采用多因素Cox回归分析,术前CTCs≥5及淋巴结转移是影响预后的显著因素.结论:免疫磁珠负性富集结合免疫荧光鉴定的方法可以有效地分离和鉴定食管癌外周血CTCs.初步研究提示,外周血中CTCs与食管鳞癌分期、进展及其预后相关.     

海水诱导血管内皮细胞株304细胞凋亡的实验研究

目的探讨海水诱导的细胞死亡特点及其分子机制。方法海水与生理盐水按照不同比例稀释以及处理不同时间条件下,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色并在荧光显微镜下观察血管内皮细胞株(endothelial cell of vessels,ECV)304细胞形态和生存改变,采用膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶双染色结合流式细胞术观察ECV304细胞凋亡比例,采用实时定量聚合酶链式反应陈列芯片杂交分析凋亡相关基因表达水平的变化。结果海水刺激早期,ECV304细胞脱水皱缩,随时间延长,细胞凋亡与坏死逐渐增多。荧光显微镜和流式细胞术分析结果显示,海水∶生理盐水=1∶1稀释不仅导致细胞坏死,还能够诱导细胞凋亡,两者比例相当。实时定量聚合酶链反应陈列芯片杂交分析结果显示,有4个凋亡相关基因[半胱天冬酶-6、脂肪酸合成酶配体基因、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和BCL-2样蛋白1(BCL-2 like 1,BCL-2L1)]RNA水平发生明显改变。结论海水可以诱导细胞凋亡,可能与其诱导的凋亡相关基因表达改变有关。     

参附注射液对海水浸泡性体温过低症大鼠的保护作用

目的研究参附注射液对海水浸泡性体温过低症大鼠血液生化指标和炎症等指标的影响及对各器官的保护作用,探讨可能的保护机制。方法将81只SD大鼠随机分为正常对照组(NC,6只)、低温对照组(DC,15只)、生理盐水注射组6 h(YW6,15只)、参附注射液组6h(SF6,15只)、生理盐水注射组12h(YW12,15只)、参附注射液组12 h(SF12,15只)。NC组为正常对照组,不做任何处理;DC组是低温海水浸泡组,浸泡完毕即刻采样;SF和YW组是实验组,大鼠分别在实验前3 d每天连续腹腔注射参附注射液或者生理盐水,剂量为15 mL/kg。各实验组大鼠在15℃低温海水中浸泡5 h后再次注射,被动复温6 h和12 h后取材,记录为SF6/12和YW6/12。记录各组大鼠的死亡率,体温的降温、升温时间及速率,生理状态(呼吸、心律、肌颤、腹温),血液生化指标(谷丙氨酸转氨酶(ALT)),谷草转氨酶(AST),乳酸脱氢酶(LDH),血肌酐(Cr)及器官的病理变化。结果SF组大鼠死亡率17%,YW组死亡率40%,P<0.05。SF组降温时间长于YW组,降温速度较YW短,P<0.05;相同观察时间点,SF组相比YW组的血液中炎症指标、生化指标都明显恢复更快,组织病理分析伤情较轻。结论参附注射液处理后能够降低海水浸泡性体温过低症大鼠的死亡率,改善低温大鼠生理指标、血液生化及炎症指标和脏器组织的损伤,对致伤大鼠起到保护作用。     

联合应用抗CK及EpCAM抗体检测食管癌外周血循环肿瘤细胞

目的:探讨联合应用抗细胞角蛋白抗体（cytokeratin，CK）及抗上皮特异性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)免疫磁珠富集循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的方法，用于提高食管癌患者外周血循环肿瘤细胞检测率。方法:将不同数量的食管癌细胞系（KYSE-170、KYSE-180、EC0156）分别与健康志愿者外周血混合后，比较单独使用抗体磁珠及联合使用双抗免疫磁珠时肿瘤细胞的检出率；并应用优化的方法对20例食管癌患者外周血中的CTCs进行富集鉴定。结果:联合应用抗CK和EpCAM抗体用于富集外周血中CTCs的方法能够提高肿瘤细胞的检出率，其差异具有统计学意义（P<0.05）；应用优化的方法富集食管癌外周血中的CTCs检出率为75%。结论:联合应用抗CK和EpCAM抗体的免疫磁珠检测体系能够用于检测食管癌外周血中的CTCs，对指导患者的个体化治疗有较高的临床意义。     

彩超诊断卵巢巧克力囊肿113例体会

目的:探讨卵巢巧克力囊肿的超声表现特征和彩色多普勒血流信号及鉴别诊断.方法:使用彩色多普勒超声诊断仪对经手术病理证实的113例卵巢巧克力囊肿采用腹部或阴道常规切面扫查,以二维图像清晰显示出子宫及两侧附件,并测量病灶大小,再对病灶进行彩色多普勒血流显像.结果:113例病例中超声提示为卵巢巧克力囊肿的101例,单纯性卵巢囊肿1例,卵巢畸胎瘤3例,盆腔炎性包块3例,宫外孕1例,卵巢实质性肿瘤4例.经手术病理证实为卵巢巧克力囊肿的99例,14例经超声导向穿刺送病理检查证实,手术病理对照诊断符合率为89.38%,误诊率为10.62%.结论:结合包块的二维回声、彩色多普勒血流显像等超声特征能提高卵巢巧克力囊肿的诊断.     

海水浸泡降低血管内皮细胞迁移能力并抑制血管生成

目的:观察海水浸泡对血管内皮细胞迁移和血管生成的影响,为探讨海水致伤机制、制定科学救治原则提供实验依据.方法:建立ECV304细胞划痕创伤模型,分别给予生理盐水和人工海水浸泡处理,划痕创伤愈合修复分析观察细胞迁移能力;建立人食管鳞癌EC0156裸鼠皮下移植瘤模型,分别给予生理盐水和人工海水干预,监测肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,观察肿瘤边缘血管的生成,免疫组织化学染色检测肿瘤组织内微血管密度.结果:海水浸泡后,ECV304细胞失去正常形态,并随浸泡时间的延长,呈明显"脱水"状态.在划痕后17 h,对照组划痕已基本愈合,而实验组仍可见清晰划痕,且以实验4 h组划痕尤其明显.与对照组相比,实验组细胞划痕愈合明显延迟,细胞迁移能力降低;与对照组相比实验组肿瘤边缘新生血管较少,前者肿瘤边缘新生血管较丰富,两者有显著性差异(微血管密度值:1.2±0.44 vs 3.2±0.83,P<0.05).实验组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积较小(P<0.05).结论:海水浸泡能够降低血管内皮细胞迁移能力并抑制血管生成.     

阿魏酸钠对高脂血症致动脉粥样硬化过程中胆固醇和甘油三酯代谢的影响

目的：观察阿魏酸钠(SF)对高脂血症引起的动脉粥样硬化(AS)过程中胆固醇和甘油三酯代谢的影响，进一步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法: 高胆固醇喂养复制AS动物模型；以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）与小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外共培养，诱导建立泡沫细胞模型，与人肝母细胞瘤细胞株HepG2细胞体外共培养，建立损伤细胞模型；分别给予SF进行干预。检测实验动物AS斑块面积和血脂水平，油红O染色观察RAW264.7细胞内脂质堆积情况，高效液相色谱定量分析RAW264.7细胞内胆固醇的含量，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定HepG2细胞肝脂酶（HL）mRNA的表达水平。结果: (1)与高脂组相比，高脂+SF组动物主动脉粥样斑块面积明显减小（P<0.01），血浆甘油三酯水平显著降低（P<0.01），但血浆胆固醇水平无明显改变（P>0.05）；(2) 与ox-LDL组相比，ox-LDL+SF处理组中HepG2细胞HL mRNA表达水平显著增加（P<0.01），但RAW264.7细胞内胆固醇含量无明显改变（P>0.05）。结论: SF能降低高胆固醇导致的AS斑块面积，具有抗动脉粥样硬化的作用，其作用机制可能与上调HL mRNA表达水平从而降低血浆甘油三酯水平有关，而与血浆胆固醇水平和ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞形成无关。提示血浆甘油三酯升高是AS的独立危险因素，HL介导的甘油三酯代谢途径可能是AS治疗的潜在靶点。     

两种不同肺叶切除术治疗肺癌的临床效果比较

目的：探讨胸腔镜辅助小切口肺叶切除术治疗肺癌的临床疗效。方法收集120例患者的临床资料，分为试验组和对照组，各60例，试验组行胸腔镜辅助小切口肺叶切除术，对照组行传统开胸术。结果试验组切口长度（5.3±1.2）cm，手术时间（143.4±27.1）min，淋巴结数（7.8±0.4）枚，术中出血量（248.4±76.3）mL，引流时间（3.1±0.5）d，术中镇痛时间（1.9±0.3）d，住院时间（9.4±2.4）d，对照组上述指标分别为（27.6±3.2）cm、（142.6±26.8）min、（8.1±0.6）枚、（497.3±94.6）mL、（5.6±0.9）d、（3.6±0.7）d、（16.4±2.6）d，切口长度、术中出血量、引流时间、术后镇痛时间和住院时间对比，试验组显著优于对照组（P＜0.05）。试验组患者的身体状况评分（18.3±1.2）、情感状况（17.5±1.3）、功能状况（18.7±2.4）、社会/家庭状况（13.2±3.1）、附加状况（20.1±2.1）、总分（87.8±8.3），对照组身体状况（14.9±1.1）、情感状况（12.1±1.4）、功能状况（14.1±1.9）、社会/家庭状况（13.1±3.0）、附加状况（15.3±1.5）、总分（69.5±6.7），试验组患者身体状况、情感状况、功能状况、附加状况和总分均显著优于对照组（P＜0.05）。结论胸腔镜辅助小切口肺叶切除术治疗肺癌创伤小、术中出血量少，提高患者的生活质量，是值得临床推广使用的手术方式。