表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

异种输血--猕猴受输猪红细胞的初步研究

本研究的目的是改造猪红细胞（pRBC）表面抗原，使之与灵长类动物相容，以探讨异种输血的可能性。结合使用α半乳糖苷酶（AGL）酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰改造猪红细胞表面异种抗原，并输注给猕猴，观察pRBC在猕猴体内活存时间及安全性；使用免疫抑制剂（蛇毒因子CVF和地塞米松）延长pRBC在猕猴体内的存活时间；建立失血性贫血猕猴模型，观察输注pRBC治疗失血性贫血猕猴的可能性。结果表明：AGL酶解能够去除猪红细胞表面主要异种抗原（α—Gal抗原），减弱其与猕猴血清的凝集反应，酶解技术与mPEG修饰技术结合可以使猪红细胞与猕猴血清更为相容。异种输血试验表明，双修饰的pRBC在猕猴体内存活时间为12小时，使用免疫抑制剂后，可延长至40小时；pRBC在猕猴体内8小时的存活率为38％，在输注pRBC的8小时内，失血猕猴的血红蛋白和红细胞压积可维持在失血前的正常水平。结论：改造后的pRBC可安全地输注给猕猴，改善失血猕猴的贫血症状．提示用猪红细胞进行异种输血是可能的。     

脑胶质瘤患者组织和血清MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态检测

目的 探讨脑胶质瘤患者组织和血清中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛甲基化发生率及相关性.方法 甲基化特异性PCR(MSP)检测39例脑胶质瘤组织样本及32例预处理的脑胶质瘤血清样本中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态.结果 脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2 %、10.3 % 和20.5 %,肿瘤组织中至少有一种基因甲基化的发生率为64.1 % (25/39);在脑胶质瘤患者外周循环血液中检测到了相关基因甲基化系列,并且与组织中基因甲基化发生率明显相关.结论 MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,血清中相关基因DNA甲基化检测有可能为脑胶质瘤诊断和个体化化疗提供一种稳定的无创性检测指标.     

损伤控制性复苏及其对野战输血研究的启示

战伤引起的急性凝血病是导致重度失血伤员死亡的关键因素。美军在2006年提出了以预防急性凝血病为前提的战伤休克救治方案,即损伤控制性复苏方案,大大降低了重度失血伤员的死亡率。本文综述了凝血病对战伤救治效率的影响、凝血病产生的机制、损伤控制性复苏方案及其战伤救治中的应用等,并讨论了损伤复苏方案对我军野战输血研究的启示。     

MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态对脑胶质瘤预后的影响

目的探讨脑胶质瘤DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和错配修复基因（MMR）（hMLH1、hMSH2）启动子甲基化状态及其对患者预后和烷化剂化疗敏感性的影响。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定其蛋白表达。绘制Kaplan-merier生存曲线。结果脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,而正常脑组织相应基因启动子区未发生甲基化;三种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似。MGMT基因甲基化的脑胶质瘤患者存活率显著高于未甲基化者（P〈0.05）;MMR基因甲基化患者中MGMT基因甲基化与未甲基化者的生存期无统计学差异（P〉0.05）。结论hMLH1、hMSH2及MGMT甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件;联合检测MGMT、hMLH1和hM-SH2基因启动子甲基化状态可判断脑胶质瘤患者的预后及其对烷化剂化疗的敏感性。     

a-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的制备a-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)的高效价高特异性的兔多克隆抗体。方法利用pET22b-NA-GA/BL21(DE3)工程菌株表达NAGA,经Ni2+Sepharose 6 FF亲合层析,Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析两步纯化,得到纯度95%的NAGA作为抗原免疫新西兰白兔,获得NAGA的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,用Western blotting评价抗体特异性。结果制备得到的NAGA兔多克隆抗体血清效价为1×106,经过rProtein A柱纯化后抗体蛋白纯度95%,效价为1×105;Western blotting显示:该NAGA兔多克隆抗体只与NAGA发生特异性反应。结论获得了NAGA的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

重组人α-半乳糖苷酶A在CHO细胞中的表达及鉴定

目的 构建重组人α-半乳糖苷酶A(GLA)真核表达载体,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达重组的人GLA.方法 利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人GLA cDNA,并构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A中.将重组质粒转染CHO细胞并用G418筛选.用丁酸钠诱导G418抗性细胞,检测培养上清中的GLA活性,筛选高表达GLA的细胞株.采用HisTrapTM FF纯化培养上清中的GLA蛋白并利用Western 印迹进行鉴定.结果 成功构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达,得到高表达量的单克隆(蛋白比活为1935 U/mg).纯化后的培养上清在50×103(Mr)附近出现单一条带,通过Western 印迹确定为GLA蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,获得了具有生物活性的重组人GLA,为临床上治疗法布莱病奠定了一定基础.     

异种(猪)脱细胞真皮基质粉对表皮细胞和成纤维细胞的促进作用

目的观察冷冻研磨获得的脱细胞真皮基质粉(ADMP)生物学性状,探索高纯度且保留生物活性的异种(猪)ADMP对表皮细胞和成纤维细胞生长的支持及在皮肤创伤修复中的应用。 方法选取幼龄长白猪背部皮肤,经生物酶法脱细胞、冷冻干燥后经过不同冷冻研磨程序得到异种(猪)ADMP,再由⁶⁰钴辐照获得无菌异种(猪)ADMP;通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察异种(猪)ADMP颗粒大小及胶原形态,确定适合应用的研磨程序;通过MTT法检测HaCaT细胞和BJ人皮肤成纤维细胞在不同浓度异种(猪)ADMP包被下的黏附作用,确定异种(猪)ADMP实现细胞最大黏附的浓度范围;DMEM培养液基添加异种(猪)ADMP为实验组,单纯DMEM培养液基为对照组,使用实时细胞分析技术分析BJ人皮肤成纤维细胞迁移指数,验证异种(猪)ADMP对成纤维细胞的促迁移作用;原代表皮细胞接种在异种(猪)ADMP培养液8 d,绘制增殖曲线,检测异种(猪)ADMP对原代表皮细胞的促增殖作用,同时免疫荧光检测原代表皮细胞表面成熟与分化蛋白的表达。对数据进行Student′s t－检验。 结果1、2、3、5、7、10次循环研磨获得异种(猪)ADMP,肉眼可见全部为白色、无块状,其中1、2、3次循环呈较粗颗粒;5、7、10次循环呈现集中均匀趋势,粒径分布在0～12 μm之间。其中5次循环粒径(13.00±2.10) μm与7次循环[(6.00±0.96) μm比较,差异有统计学意义(t＝6.093,P＝0.0002)。异种(猪)ADMP透射电子显微镜下发现,不同循环次数获得的异种(猪)ADMP均能保留大量胶原分子。BJ人成纤维细胞和HaCaT细胞随包被浓度的增加,细胞黏附作用不断增强,浓度高于750 μg/cm²,无明显变化。实时细胞分析技术检测BJ人皮肤成纤维细胞在DMEM培养液基对照组培养液72 h后的迁移指数为1.21±0.10,而异种(猪)ADMP培养液基试验组的迁移指数为3.66±0.11,两组比较差异有统计学意义(t＝22.24,P＝0.002)。在异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞形态统一增殖迅速,对照组出现一定比例的分化细胞,试验组与对照组第5天细胞数分别为(4.11±0.28)×10⁵、(1.10±0.12)×10⁵个,两组比较差异有统计学意义(t＝13.51,P＝0.005);第8天细胞数分别为(5.00±0.48)×10⁵、(3.05±0.30)×10⁵个,两组比较差异有统计学意义(t＝4.87,P＝0.039),增殖曲线显示试验组在接种即日培养液至第5天,一直处于指数增长期。荧光染色中异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞E-cad全部表达,少量表达角蛋白10,整合素α6几乎全部强阳性,角蛋白14全部表达并有部分强阳性,Ki-67抗原表达率高。 结论通过生物酶解和冷冻研磨获得的异种(猪)ADMP对参与皮肤创伤修复最重要的表皮细胞和成纤维细胞,具有促进其增殖和迁移的作用,未来可进一步应用于皮肤创伤修复。     

抗内甲基转移酶单克隆抗体的制备及临床应用研究

目的：建立抗人甲基转移酶单克隆抗体细胞株并建立相应的蛋白测定方法,观察脑瘤组织中O^6-甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）表达水平与亚硝脲药物疗效的关系,方法：采用细胞融合技术建立抗人甲基转移酶单克隆抗体细胞胞株,采用免疫组织化染色方法,检测60例脑瘤组织中MGMT表达水平,结果：得到了7株分泌抗人甲基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并建立了测定MGMT免疫组化方法,观察的60例脑瘤组织中有27例MGMT阴性,经亚硝脲药物治疗,其中24例好转,3例复发,另3例MGMT可疑阳性的患者,经亚硝脲药物治疗,其中2例好转,1例复发,25例MGMT阳性患者,经亚硝脲药物治疗,5例好转,12例复发,8例死亡,5例MGMT为强阳性患者,使用亚硝脲药物治疗无效,全部死亡,结论：建立了7株稳定分泌抗人甲基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株及MGMT蛋白测定方法,为临床开展亚硝脲预见性化疗提供了必要手段,初步结果显示,脑瘤组织中MGTM表达水平与亚硝脲药物疗效及预后有关,是肿瘤细胞对亚硝脲药物产生耐药性的基础。     

MGMT基因启动子甲基化检测在脑胶质瘤化疗中的意义

背景与目的：如何预测和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,实施个体化治疗是肿瘤化疗急需解决的问题。与基因启动子甲基化密切相关的DNA损伤修复基因O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O^6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT）表观沉默与肿瘤对烷化剂药物化疗敏感性密切相关。本研究探讨检测MGMT基因启动子CpG岛甲基化在判断脑胶质瘤患者预后及预测肿瘤对烷化剂药物耐药性中的意义。方法：甲基化特异性PCR（MSP）法检测脑胶质瘤组织及肿瘤细胞株MGMT基因启动子甲基化状态,蛋白印迹和免疫组化法测定蛋白表达。MTF法检测肿瘤细胞株对烷化剂药物敏感性,将患者随访资料针对MGMT甲基化状态绘制Kaplan-Meier生存曲线,并进行log—rank检验分析。结果：39例脑胶质瘤患者组织MGMT基因启动子甲基化发生率为46．2％,蛋白表达阳性率为61．5％,且肿瘤组织中MGMT基因甲基化状态与蛋白表达显著相关（P〈0．05）：6例正常组织均未检测出基因甲基化。MGMT基因过甲基化的脑胶质瘤SHG44细胞株用5-Aza-CdR处理后完全脱甲基化．MGMT蛋白恢复了表达,同时细胞株对烷化剂药物敏感性也发生逆转．由敏感转变为耐受。在采用手术、放疗和烷化剂尼莫司汀化疗等综合治疗的39例脑胶质瘤患者中,MGMT基因甲基化的患者生存率显著高于MGMT基因未甲基化患者（P〈0．05）。结论：MGMT基因甲基化状态与蛋白表达及肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性密切相关,有可能替代MGMT蛋白检测成为判断脑胶质瘤患者预后和预测肿瘤对烷化剂化疗耐药性的标志分子。