CAR-T制备工艺中PD-1表达的动力学研究

目的 研究嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒对T细胞中程序性死亡因子1(PD-1)蛋白表达的影响,为改善其体内抗肿瘤活性研究提供理论依据.方法 筛选高表达PD-1细胞系,添加CAR-T制备工艺中抗CD3/CD28磁珠和慢病毒(CAR-GFP、CAR-CD19、CAR-CD30),流式细胞术检测T细胞系PD-1蛋白的变化.利用PD-1刺激剂研究CAR-T制备中PD-1的表达.结果 流式细胞分析显示,抗CD3/CD28磁珠和CAR-CD30慢病毒能显著刺激Jurkat中PD-1蛋白表达[(63.5±4.9)％和(63.0±5.3)％,P?0.01].Jurkat添加0.5:1抗CD3/CD28磁珠刺激后,PD-1表达量在48 h为最大值,之后随时间增加PD-1蛋白表达下降,144 h时下降到(4.5±0.3)％以内.CAR-CD30慢病毒以MOI=3感染复数刺激Jurkat后PD-1蛋白表达比较稳定.T淋巴细胞中添加抗CD3/CD28磁珠能提高约3倍PD-1的表达.结论 低浓度抗CD3/CD28磁珠能短暂性刺激T细胞中PD-1蛋白表达且不影响其活率.     

靶向CD33 的CAR修饰的NK92 细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用

[摘要] 目的：根据抗CD33-scFv 序列构建CD33-CAR 修饰的NK92 细胞,探讨其对CD33+ 急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）细胞的杀伤作用。方法：通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92 细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ 分泌的变化。结果：成功构建pCDH-CD33-CAR 重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7%的NK92 细胞表达CD33-CAR（命名为CD33-CARNK92细胞）,嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92 细胞比例约86.3%。CD33-CAR-NK92 细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92 细胞（P<0.01）,而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT 的杀伤作用没有明显差异（P>0.05）。效靶比为2∶1 共培养6 h 后,经CD33-CAR修饰的NK92 细胞相比未被基因修饰的NK92 细胞IFN-γ 的分泌水平明显升高[ （190.97±11.52）vs（88.41±2.75）pg/ml, P<0.01]。结论：CD33-CAR-NK92 细胞能特异性识别CD33 抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92 细胞,为进一步开展靶向CD33 的CAR-NK92 细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础。