酶联免疫吸附法和DNA检测法在肉类鉴别中的应用

肉类食品是我国人民食品消费的主要组成部分,企业和经营单位为了追逐利润,时有将价格便宜的肉品掺入或替代高价格的肉品中进行加工和销售。为保护消费者对食品消费的知情权和规范肉类市场的秩序,食品生产、流通等监管部门应对肉类识别技术进行系统的分析和研究,进而建立相应的规范识别方法。目前用于肉类掺假鉴别的方法有组织学、化学、免疫学和基于DNA序列的检测方法等。本文主要针对ELISA检测方法和DNA检测方法在肉类识别中的应用进行阐述分析,并对我国肉类识别标准方法的缺陷进行分析。     

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

基于DNA测序方法检测生鲜肉中5种动物源性成分

目的建立生鲜肉中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对采集自北京各地区生鲜肉品进行检测验证。方法合成动物线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物,建立猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对50份猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行检测。结果使用线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物对猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行扩增,分别获得456、400和710 bp大小的DNA片段。只有12S rRNA基因引物均可对此5种动物源性成分扩增且效果良好。扩增产物进行序列测定。根据序列构建的系统进化树发现,此方法可有效区分样品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分。结论此方法快速、简便,可准确检测50种生鲜肉样品中的动物源性成分,作为肉类鉴别的新方法。     

诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的 制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程的质量控制。方法 1、对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCC Ph001)进行分子生物学的确认。2、将大肠杆菌噬菌体MS2培养物,采用冷冻干燥技术制成一定含量的微球。3、均匀性检验：取15件样品进行均匀性检验,采用三倍标准差原则对结果进行分析;4、长期稳定性检验：将样品放置于-20℃,于1个月、3个月、6个月、12个月取样,每个时间点取3个样进行检测进行分析。5、短期稳定性：样品放置于4℃和37℃环境,于1天、3天、5天、11天和1天、5天、7天、14天、28天,每个时间点取3个样进行检测。6、组织3家实验室进行协同标定。7、使用牡蛎、青蛤、甜瓜、胡萝卜、生菜等样品,作为贝类、硬质表面、蔬菜等样品代表对大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的使用效果进行确认。结果1、MS2大肠杆菌噬菌体分子生物学鉴定结果为大肠杆菌噬菌体MS2(Coliphage MS2)。2、采用冷冻干燥技术制备的大肠杆菌噬菌体MS标准物质微球,呈球形、白色、大小均一,符合制备的预期。3、采用三倍标准差原则,对样品均匀性检验结果分析,检测结果值都在平均值±三倍标准差范围内,均匀性符合要求;4、经-20℃,12个月长期稳定性监测,样品仍然稳定,-20℃可以作为长期储藏的条件;5、经4℃ 28天、37℃ 5天的短期稳定性监测,样品仍然稳定,,证明样品可以采用常温的方式进行运输,4℃条件可以作为短期样品储存的条件。 6、经3家实验室协同标定,样品检测结果为阳性,CP值与均匀性检验的平均值比较差异不大,可以作为过程质量控制使用。7、以牡蛎、青蛤、甜瓜、胡萝卜、生菜等样品作为基质进行实用性验证,表明可以作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质使用。结论 大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2(Coliphage MS2)的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。     

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的 为满足实验室酵母菌日常检验质量控制需求及实验室间比对,制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质。方法 通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及ITS位点测序对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,刮取适宜菌苔于保护剂中混匀后冻干,制备10_⁴ CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.15,将研制的本标准物质加入7类食品基质共20件样品中进行检验,验证真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对本标准物质进行协作标定。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序结果与NCBI Genbank中已有序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica(Accession number ：CP061015.1;Query Cover：95%;Ident：100%)。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析计算F_0.05(19,20)=2.137,F值为1.697,F＜F_0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃培养箱中放置7天,标准物质中菌含量仍保持在10_⁴ CFU/样品,可保持稳定。标准物质于4 ℃储存28天及-20 ℃储存90天,菌含量为10_⁴ CFU/样品,复苏率均在91%以上,说明4 ℃放置较短时间及-20 ℃放置较长时间样品稳定。7类食品样品基质中加入本标准物质后进行检验,均可检出,回收率为81.3%。经三家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0～3.0×10_⁴ CFU/样品。结论 本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌定性检验,今后可作为实验室日常检验工作的阳性对照质控样品,也可作为实验室间比对样品发放,以保障日常检验工作结果可靠性,进一步提升检验机构人员的检验水平。     

食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的制备方法, 研制均匀稳定的标准物质,用于实验室内部质量控制。方法采用冷冻干燥技术制备含量为4-5×104CFU/样品的菌球,参照《CNAS-GL29：2010标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,随机抽取20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20℃、4℃、25℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。并组织3家实验室进行协同标定,再使用20件食品作为基质,按照国标法检验大肠埃希氏菌标准物质的适用性。结果对20瓶标准物质的均匀性检测结果进行单因子方差分析： F=1.933, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d,复苏率为96.2%;在4 ℃保藏14 d,复苏率为77.0%;25 ℃保藏7 d,样品中菌含量仍保持在104CFU/样品的水平,说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在104CFU/样品水平,生化鉴定结果均符合大肠埃希氏菌的特征;标准物质加入到20种食品基质中, 均可以检出大肠埃希氏菌,活菌含量仍保持在104CFU/样品的水平。结论本研究所制备的大肠埃希氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中大肠埃希氏菌检测结果的评价。     

甲烷八叠球菌的富集培养和固定化介质的选择

用亨盖特（Hungate)厌氧技术，以甲醇为唯一碳源，获得了甲烷八叠球菌的富集培养物，采用直接计数法和MPN（most probable number)法对甲烷八叠球菌的数量进行测定，选择不同包埋剂对甲烷八叠球菌进行固定化，并对其成球效果及产甲烷特性进行了研究，结果表明，以AM4为包埋剂对甲烷八叠球菌进行固定化可得到较好的效果。     

弯曲菌菌种冷冻保存及复苏方法的研究

目的探索一种简单、方便、有效的弯曲菌菌种保存方法。方法采用含30%甘油的脑心浸液肉汤,将实验室保存的19株弯曲菌于-30℃和-70℃分别保存,每个菌株3个菌种管。1年后,采用5%脱纤维羊血的布氏肉汤进行增菌,然后转种哥伦比亚血平板,比较存活效果。结果-30℃条件下采用多管法保存弯曲菌可以获得与-70℃条件下保存相当的效果。结论采用多管法（每株菌3个菌种管）于-30℃冷冻保存弯曲菌是一个简单、方便、有效、实用的方法。     

食品安全国家标准中菌落总数测定方法影响因素分析

目的 对GB 4789.2-2016菌落总数测定方法的重要影响因素进行了系统分析。方法 使用大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538和枯草芽孢杆菌ATCC6633的新鲜菌株和冻干样品评价PCA培养基的倾注温度(45 ℃和50 ℃)、已处理样品放置时间(0~90 min)、培养基倾注体积(12~20 mL)、培养基品牌(7种, 编号A-G)的差异对菌落总数计数结果的影响。结果 已处理样品放置90 min后, 菌落总数的计数结果显著性低于放置0 min(P=0.023)和15 min(P=0.021)样品的计数结果; 使用品牌B培养基得到的菌落计数结果显著性低于使用品牌F培养基得到的结果(P=0.024)。PCA培养基倾注温度(45 ℃和50 ℃)和倾注体积(12~ 20 mL)对菌落总数计数结果的影响未见显著性(P>0.05)。结论 需细化国标菌落总数测定方法检验流程, 研发并引入可靠的参比培养基, 对检验过程予以高度规范化, 以保障检验数据稳定、可靠。     

食品中3M™克罗诺杆菌属分子检测系统评价研究

目的：用不同来源的克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）、不同来源的非目的菌及不同来源的人工染菌食品样品,考核评估3M? MDS分子检测系统（以下简称3M? MDS）对克罗诺杆菌属的检出限、灵敏度、特异性和准确度,以及与国标法（GB4789.40-2016）检验结果的一致性。方法：用3M? MDS对实验室保存的50株已确认克罗诺杆菌属、40株非目的菌株进行检测,确定该试剂盒的检出限、灵敏度和特异性;对240份人工污染不同浓度目的菌样品,用3M? MDS和国标法同时检验,分析方法的准确度和检验结果的一致性。结果：3M? MDS对50株不同来源的克罗诺杆菌属的检测灵敏度为100%,平均检出限为1.79×103CFU/mL;对40株非目的菌检测结果均为阴性,特异性为100%。用3M? MDS与国标方法对人工污染101 CFU/100g、100 CFU/100g 、10-1 CFU/100g克罗诺杆菌属FC718的240份不同来源乳粉、糊精、乳清和乳糖样品进行检测,结果一致性均大于95%,方法准确度为97.5%。结论：3M? MDS方法具有低检出限、高灵敏和特异性特点,在不同食品样品基质中,检验结果呈现良好的准确度,与国标方法检验结果具有高度一致性,是一项适合基层、企业推广的快速、可靠方法。