构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。