热诱导潜在食物中毒威胁源重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素去折叠及聚合过程

热失活工艺是降低加工食品中潜在的细菌和毒素含量的有效手段。M型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins M,SEM）归属于V型超抗原,具有较弱的催吐活性,是一种潜在的金黄色葡萄球菌所致食物中毒威胁源。本研究利用圆二色光谱、荧光光谱、变性/活性聚丙烯酰胺凝胶电泳监测重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素（recombinant staphylococcal enterotoxin M,rSEM）热诱导变性过程。结果表明,在低于40 ℃时,rSEM具有富含α-螺旋（17%）、β-折叠（32%）、转角（21%）的天然折叠态结构,分子表面唯一的121号色氨酸残基位于β-掌型结构域中相对疏水的环境中。随着温度从42 ℃升高到55 ℃,rSEM二级结构中减少的α-螺旋含量被增加的β-折叠/转角含量所弥补,蛋白质分子之间聚集状态未发生明显改变,最大荧光发射波长明显蓝移,同时350 nm和340 nm波长处的荧光强度比表现出反S型曲线,说明42～55 ℃温和加热可导致另一种形式的rSEM折叠中间态（intermediate state,IS）形成。在55～90 ℃温度范围内,rSEM二级结构基本维持稳定。与此同时,当加热温度从65 ℃升高至80 ℃时,350 nm与340 nm波长处的荧光发射强度比并未显示出蛋白处于完全变性状态,说明在加热过程中rSEM二级结构基本维持稳定,而三级结构具有较大动态变化的可能性,这可能与β-掌型结构域可以通过诱导契合结合具有不同构象的主要组织性相容复合体等位基因产物有关系。此外,在70 ℃乃至更高的温度,rSEM的聚集程度明显增加并且在90 ℃时达到最大。综上,rSEM中间态形成、聚合体产生以及稳定的β-折叠/转角结构是该蛋白在高温下依然保持热稳定性的基础。通过对rSEM热诱导去折叠过程的研究有助于阐明rSEM耐热机理,未来利用该方法对其他各类金葡菌肠毒素热失活机制进行类似研究将利于食品安全性生产工艺过程的改善。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK原核表达、纯化及溶液构象分析

金黄色葡萄球菌K型肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxin K,SEK）由金黄色葡萄球菌肠毒素基因簇编码,流行病学显示,编码SEK蛋白的sek基因在食品源金黄色葡萄球菌菌株中具有较高的检出率,说明SEK也可能是一种重要的食品中毒潜在致病因子。本研究将截去N端信号肽的SEK蛋白编码基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-ΔNspsek;通过对sek基因在不同原核表达宿主菌中的表达及表达条件优化分析,确立SEK蛋白的最优表达条件;利用镍亲合层析纯化含组氨酸（His）标签的SEK融合蛋白,将凝血酶切除His标签后的SEK蛋白进行聚合状态及热稳定分析、荧光发射谱和圆二色谱分析。结果表明,重组蛋白SEK表达成功,热处理导致蛋白部分降解;荧光光谱揭示SEK蛋白在278?nm和295?nm波长处具有相同的最大色氨酸发射峰;344?nm波长处表明SEK蛋白处于紧密折叠的天然状态;圆二色谱分析表明,ΔNspSEK重组蛋白富含β-折叠（23.6%）、β-转角（28%）以及α-螺旋（29.1%）等二级结构。为深入研究SEK蛋白的结构与功能提供基础,也对改进食品加工工艺和提高食品安全具有指导意义。     

培养条件对阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株生物被膜形成的影响

目的研究不同培养条件对阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株生物被膜形成的影响。方法从23株阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株中筛选5株菌株作为研究对象,利用试管法和96孔微板法检测不同培养条件下阪崎克罗诺杆菌的菌膜形成情况。结果 5株菌株在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(triptych soy broth,TSB)中均具有较强的成膜能力;培养基中添加不同浓度的营养因子对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成影响不同,葡萄糖对5株阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株的成膜能力有明显促进作用,乳糖的添加对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成有一定影响,但蔗糖的添加对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成影响不明显;培养基中添加一定浓度的氯化钠可以有效抑制阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成;p H对阪崎克罗诺杆菌的成膜能力也有一定影响,中性环境有利于阪崎克罗诺杆菌的被膜形成。结论阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株具有形成细菌生物被膜的能力,并且不同培养条件对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成影响不同。     

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。     

大蒜汁对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌食品分离菌株的生长和生物被膜形成的影响

研究紫皮蒜和白皮蒜汁对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长和生物被膜形成的影响。以紫皮蒜和白皮蒜为原料制备大蒜汁;采用平板抑菌实验研究两种大蒜汁对7株MRSA食品分离菌株的抑菌效果;同时采用96孔板法研究两种大蒜汁对MRSA细菌生物被膜形成影响。结果表明:白皮蒜与紫皮蒜汁对于7株MRSA食品分离菌株均具有明显抑菌效果,抑菌圈大于19 mm,紫皮蒜汁效果优于白皮蒜汁,紫皮蒜汁的最低抑菌浓度为6.25 mL/L,白皮蒜汁的最低抑菌浓度为12.5 mL/L;两种大蒜汁在不同亚抑菌浓度下对MRSA的生物被膜形成均具有明显抑制作用。本研究结果为MRSA菌株的消除和防控措施提供参考。     

金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法研究

本研究目的是建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 SEP 的双抗夹心酶联免疫方法。通过对单克隆抗体和抗血清质量浓度、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 Ig G（Ig G/HRP）最佳稀释度、不同种类包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（TMB）显色时间等条件进行优化;并采用灵敏度、批内和批间变异和加标回收率等对方法进行评价。结果表明：该方法中抗 SEP 单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为 3.28 μg/m L,抗 SEI 兔血清的质量浓度为 3.14 μg/m L,酶标二抗稀释度 1:3000,1×磷酸缓冲盐溶液（p H 7.4）为最佳包被缓冲液,封闭时间为 1 h,抗原孵育时间为 90 min,酶标二抗反应时间为 30 min,TMB 显色时间 15 min。该方法回归方程为 y=0.0313x+0.0262,R2=0.9946。灵敏度为 1.80 μg/m L,精密度批内变异低于 6%,批间变异低于 15%,对 LB 肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率达 90%以上。     

生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究

目的:研究生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的毒力基因及耐药性。方法:在成都市周边农贸市场和路边小摊采集各种生鲜食品共100份,采用MYP选择性培养基初步分离蜡样芽孢杆菌菌株,采用16S rRNA序列比对分析鉴定得到蜡样芽孢杆菌分离菌株,采用PCR检测分离鉴定菌株中蜡样芽孢杆菌13个毒力基因的携带情况,进一步采用纸片扩散法检测菌株对18种抗生素的耐药性。结果:从100份生鲜食品样本中,检出蜡样芽孢杆菌24株,检出率为24%,其中,路边小摊的检出率(70%)高于农贸市场(18.9%)。呕吐型基因ces和cer的检出率较低,仅在1株中发现;腹泻型基因nheC有24株检出;cytK有13株检出;bceT有12株检出;hblA有11株检出;nheB有10株检出;hblC、hblD、nheA各有9株检出;hly-Ⅱ有7株检出;hblB、entFM检出率为0;蜡样芽孢杆菌的4个看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分离菌株中检出率为100%。同时发现,生鲜食品来源的蜡样芽孢杆菌分离菌株对杆菌肽B、磺胺甲亚唑、苯唑西林、青霉素表现出较高耐药性,耐药率大于96%;而对阿米卡星、氯霉素、庆大霉素、亚胺培南耐药率小于7%。结论:本研究通过分离鉴定生鲜食品源蜡样芽孢杆菌,研究其毒力基因携带及耐药性,为进一步评价生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的安全风险提供参考数据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法的建立

本研究目的是建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEP的双抗夹心酶联免疫方法。通过对单克隆抗体和抗血清质量浓度、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G(Ig G/HRP)最佳稀释度、不同种类包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺(TMB)显色时间等条件进行优化;并采用灵敏度、批内和批间变异和加标回收率等对方法进行评价。结果表明:该方法中抗SEP单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为3.28μg/m L,抗SEI兔血清的质量浓度为3.14μg/m L,酶标二抗稀释度1:3000,1×磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)为最佳包被缓冲液,封闭时间为1 h,抗原孵育时间为90 min,酶标二抗反应时间为30 min,TMB显色时间15 min。该方法回归方程为y=0.0313x+0.0262,R2=0.9946。灵敏度为1.80μg/m L,精密度批内变异低于6%,批间变异低于15%,对LB肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率达90%以上。