乳品中的酵母活菌数PMA-qPCR检测方法的建立及初步应用

本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-qPCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×102 CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6~7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。     

人松弛素H2类似物在毕赤酵母中的高效表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达人松弛素H2类似物(Human relaxin-2 analogue,HR2),并检测其生物活性。方法通过密码子优化合成HR2基因,构建重组表达质粒pPICZαA-HR2,转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。表达产物经超滤和柱层析纯化后,切除人工C肽,检测其生物活性。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pPICZαA-HR2构建正确;Tricine-SDS-PAGE分析显示,表达的重组蛋白相对分子质量约6 500,表达量占菌体总蛋白的47.6%,为451μg/ml,且为分泌表达;Western blot分析显示,重组蛋白具有良好的反应原性;纯化的重组蛋白纯度达96%;经检测C肽切除的重组HR2对THP-1细胞具有刺激活性。结论成功在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了重组松弛素H2类似物,并具有一定的生物活性。     

HEPES和NaHCO_3对RPMI-1640培养液的渗透压和pH值的影响

本文对实验室利用RPMI-1640干粉配制培养液时易忽视的渗透压和pH值等因素进行了比较分析,提出配制培养液时对渗透压和pH值控制的关键因素。     

抗疲劳复方添加剂方剂设计及其功效

本实验以螺旋藻、维生素E、L-肉碱、二十八醇、牛磺酸为原料，采用正交试验方法进行了抗疲劳复方添加剂方剂设计，得到四个较优配方；通过游泳耐力和生化指标的测定研究了四个较优配方的抗疲劳效果。结果表明，四个较优配方均能显著延长小鼠游泳时间，降低血尿素氮和血乳酸含量，具有明显的抗疲劳效果。     

PNT—PCR检测食品中沙门氏菌方法的建立及应用

本文将自行研制的一种沙门氏菌强选择性增菌液PNT与PCR技术相结合,建立了快速、特异、敏感地检测食品中沙门氏菌的PNT—PCR技术。通过对食品样品、污水样品的检测,结果表明该检测系统可检出食品中10cfu的沙门氏菌。应用本检测系统检测各类食品及污水样品612份,PNT—PCR法检出沙门氏菌198份,而常规方法检出104份,本法在特异性、敏感性及实际样品检出率方面均显示了很强的优越性。     

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

抗疲劳复方添加剂方剂设计及其功效

本实验以螺旋藻、维生素E、L-肉碱、二十八醇、牛磺酸为原料,采用正交试验方法进行了抗疲劳复方添加剂方剂设计,得到四个较优配方;通过游泳耐力和生化指标的测定研究了四个较优配方的抗疲劳效果。结果表明,四个较优配方均能显著延长小鼠游泳时间,降低血尿素氮和血乳酸含量,具有明显的抗疲劳效果。     

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA (ic-ELISA)方法.采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测.该方法的检测范围(IC20～IC80)为11 ～292 pg/mL,检测限(IC10)为6 pg/mL.玉...     

扩展青霉碱性脂肪酶结构基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)结构基因。方法提取扩展青霉总RNA,经RT-PCR扩增PEL结构基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-PEL,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,包涵体蛋白经变性、复性后,采用NaOH滴定法测定其酶活性。结果经RT-PCR扩增获得约780bp的PEL结构基因;所构建的重组表达质粒pET-28a-PEL经酶切及PCR鉴定正确;目的蛋白的相对分子质量约为28000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;发酵液及复性的包涵体蛋白酶活性可达12.44U/ml。结论已成功克隆并原核表达了PEL结构基因,为获得碱性脂肪酶高产基因工程菌株奠定了基础。     

磺胺二甲嘧啶完全抗原的制备及鉴定

目的制备磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine,SM2)完全抗原,并进行鉴定。方法采用重氮化偶联法制备SM2免疫抗原(SM2-BSA)和检测抗原(SM2-OVA),定性和定量分析偶联后的完全抗原,并制备SM2单抗。结果经1%琼脂糖凝胶电泳和10%SDS-PAGE分析表明,完全抗原SM2-BSA和SM2-OVA偶联成功;SM2与载体蛋白BSA和OVA的分子结合比分别为23∶1和17∶1;SM2-BSA和SM2-OVA的蛋白浓度分别为3.24和2.29 mg/ml;完全抗原SM2-BSA能刺激小鼠产生高效、特异的抗SM2抗体;SM2单抗与OVA和BSA无交叉反应。结论已成功制备了完全抗原SM2-BSA和SM2-OVA,为下一步建立灵敏度更高、特异性更强、操作更简便的免疫学检测方法奠定了基础。