猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为做好猪瘟的早期诊断和及时预防,建立一种快速检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的实时荧光环介导等温扩增方法。试验利用Primer Explorer version 4针对CSFV的5`UTR非编码区设计4组引物,筛选出最佳引物后建立CSFV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及适用性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法对128份临床样本和22份猪瘟活疫苗人工干扰样本的检测结果与实时荧光聚合酶链式反应检测方法一致。该方法仅对猪瘟病毒有扩增反应,且最低检测浓度为10 fg/μL,对猪伪狂犬病毒、高致病性高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等8种病原无扩增反应。本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法特异性强、灵敏度高,检测效果好,操作简单,适用于CSFV临床样本的快速检测。     

恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。     

猪伪狂犬病毒环介导等温扩增技术检测方法的建立

为建立通用性猪伪狂犬病毒(PRV)环介导等温扩增快速检测方法,本实验根据PRV gB基因序列的保守区段设计四套特异性引物,基于环介导等温扩增技术引入环引物,筛选出特异性引物PRV-1,对其特异性、灵敏度进行评估,进行临床样本和人工干扰样本检测试验,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测结果进行比较分析。结果表明该检测方法能够特异性的检出PRV的存在,具有良好的特异性;灵敏度检测下限为10fg/μL;且本文建立的检测方法其结果与临床样品和人工干扰样本qPCR检测结果具有高度的一致性。因此,本实验建立的PRV环介导等温扩增检测方法特异性强、灵敏度高,具有较好的稳定性,并且操作安全、简便、高效,该方法的建立为猪伪狂犬病的快速诊断和基层检疫提供了新的选择。     

基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分

目的建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析。方法针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP等参数的优化条件下,LAMP法对肉制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5%。结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对肉制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法。