烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析

利用引起烟草脉坏死病的马铃薯Y病毒脉坏死株系辽宁分离物（Potato virus Y-vein necrosis strain Liaoning isolate, PVYN-LN）,以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR、3’RACE和5’RACE扩增及序列测定,测得PVYN-LN全长基因组序列（NCBI登录号为JQ971975）包括9714个碱基(含PolyA尾),整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框（ORF）,编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。对所得序列进行BLAST,利用MEGA软件对所测得的PVYN-LN全序列与GenBank中已有的PVY全序列及氨基酸进行系统进化分析,发现PVYN-LN分离物与已报道的PVYN株系具有较高的进化亲缘关系,该分离物属于PVYN株系。序列重组分析软件RDP4分析,该序列无重组。     

烟草抗PVY~N突变株eIF4E基因的克隆及表达差异分析

为了明确抗马铃薯Y病毒病的相关基因、进一步揭示其抗病机制,以烟草高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)突变株SN01和SN02为试验材料,研究了突变株的抗病相关基因翻译起始因子4E(e IF4E)在寄主中的抗病作用。结果表明:从抗病突变株SN01和SN02中克隆到目的全长基因,分别命名为e IF4E01与e IF4E02,其开放阅读框ORF长度均为669 bp,编码222个氨基酸;利用MAGA4.1和CLUSTAL软件进行序列同源性比对分析表明,e IF4E01和e IF4E02与已报道的烟草e IF4E(Gen Bank:AY702653.1)基因序列相似度均达到99%,其开放阅读框序列完全一致。并与甜椒、番茄、拟南芥等物种的e IF4E家族基因也具有高度同源性;Real-time PCR结果表明,在PVYN侵染初期(接种后0~9 d),突变株SN01和SN02中的e IF4E基因表达量明显低于其感病亲本NC89和K326。说明这两个抗病突变株中的e IF4E基因的抑制表达与烟草对PVYN的抗性密切相关。     

烟草抗PVYN突变株SN01的SRAP—PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验对烟草抗PVYN突变株SN01幼嫩叶片的SRAP-PCR反应体系中5个主要因素（dNTPs、Mg2＋、TaqDNA聚合酶、引物和DNA）进行了优化以建立合适的SRAP反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,各因素的最佳加入量分别是：dNTPs（2．5mmol／L）3．2μL、Mg2＋（25mmol／L）1．6μL、TaqDNA聚合酶（2．5u／μL）0．16μL、引物（10μmaol／L）0．6gL、DNA模板120ng。对该SRAP—PCR反应程序中的退火温度和循环次数筛选表明,最佳退火温度为57℃,循环次数为35次。该优化体系的建立,为进一步对烟草抗PVYN突变株SN01的抗病基因研究提供了可靠基础。     

烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

采用烟草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合;采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明:共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合;烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20 μL;各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶>引物> Mg2+> dNTPs=模板DNA。      

嘧肽霉素诱导烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的研究

[目的]利用烟草BY-2悬浮细胞研究抗病毒新农药2%嘧肽霉素水剂诱导植物防卫反应的机制。[方法]用不同质量浓度的嘧肽霉素处理悬浮细胞,分光光度法测定胞外H2O2产生的动态过程及RT-q PCR方法测定防卫反应基因表达。[结果]烟草BY-2悬浮细胞经嘧肽霉素处理,产生活性氧迸发,并在处理1 h后达到高峰;嘧肽霉素能诱导细胞的FLS2、MAPKKK、PR1、NPR1和HSP70的上调表达,其中HSP70的上调效果最为显著。[结论]嘧肽霉素可通过诱导植物防卫反应相关基因的表达,达到诱导植物抗病毒病的作用。