传统发酵食品中分离的乳酸菌粗提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌机制研究

目的 探究乳酸菌HS011 (Lactobacillus plantarum MG5276)、德氏乳杆菌保加利亚亚种HS023 (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus strain NDO4)、嗜热链球菌HS033 (Streptococcus thermophilus 3233)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的抑菌机制。方法 以MRSA为研究对象, 探索乳酸菌粗提物对MRSA菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的影响、抗菌药物复合作用对细菌生长的影响、抽提物对MRSA生物被膜抑制和清除效果, 以及抽提物对MRSA细胞膜完整性的破坏作用等。结果 乳酸菌粗提物HS011、HS023、HS033对MRSA的MIC分别为5.75、5.00、6.00 mg/mL; 指示菌MRSA的生长过程受到粗提物明显抑制, 在6 h时HS011、HS023、HS033对MRSA的抑菌率分别为28.69%、69.20%和42.19%; 3株乳酸菌粗提物与四环素复合使用时对MRSA的抑菌效果增强, 抑菌直径分别提高了39.33%、32.00%、37.43%, 但与亚胺培南复合使用时, 其抑菌效果却减弱了; 3株乳酸菌粗提物在1 MIC时对MRSA生物被膜形成具有一定的抑制和清除效果, 对生物被膜形成的抑制率分别为27.30%、18.20%、17.57%, 对成熟被膜的清除率分别为42.10%、54.50%、45.50%; 通过测定指示菌的核酸泄漏量、胞外蛋白含量以及扫描电镜成像发现乳酸菌粗提物处理过的MRSA, 其细胞膜被破坏。结论 3株乳酸菌的粗提物通过破坏MRSA的细胞膜有效抑制MRSA的生长和生物被膜的形成, 本研究结果为乳酸菌的抑菌机制探究提供一定的基础数据。     

3株魏斯氏菌的分离鉴定与生物学特性研究

本文对泡菜发酵初期魏斯氏菌进行分离鉴定并探究其安全特性和益生特性。结果表明：共筛选出三株魏斯氏菌,鉴定并命名为融合魏斯氏菌C13、食窦魏斯氏菌G232和W212;三株菌代谢产物无毒性,对14类21种抗生素表现出不同程度耐药,耐药基因检测C13携带四环素类耐药基因tetM,G232和W212携带磺胺类耐药基因sulII;三株菌能耐受pH 1-3和3.0%以下的胆盐,在人工肠液中3 h后存活率超过76.80%;三株菌的黏附能力好,疏水性在60.47%-62.69%之间,自凝聚率在43.76%-52.55%之间,共凝聚率在43.20%-61.58%之间;对胆固醇及甘油三酯的降解主要在前15 h,在24 h的总降解率在31.64-51.15%之间;表现出一定的抗氧化能力,对1,1一二苯基-2-三硝基苦肼自由基清除较高(清除率25.69-58.12%),对超氧阴离子自由基清除率相对较低(10.08%-27.73%);三株菌对志贺氏菌、大肠杆菌等致病菌抑菌活性好(抑菌圈直径18.22-42.18 mm)。本研究结果表明筛选的三株魏斯氏菌有较好的安全性和一定的益生特性,为将来魏斯氏菌在实际生产的应用提供基础数据。     

食品中克罗诺杆菌分离菌株生物被膜形成、耐药性及毒力基因检测

研究食品中克罗诺杆菌分离菌株的生物被膜形成、耐药性以及携带毒力基因情况。在成都市周边农贸市场和路边小摊采集食品样品129份,采用DFI 阪崎肠杆菌显色培养基分离克罗诺杆菌;通过16S rRNA序列比对分析鉴定分离菌株;采用试管法和微孔板法分析菌株生物被膜形成能力,同时研究温度对细菌成膜能力影响;采用纸片法检测分离菌株对18种抗生素的耐药性;采用PCR方法检测分离菌株携带cpa、hly、sip 和ompX毒力基因情况。结果发现从129份食品样本中共检出克罗诺杆菌43株,检出率为33.3%。43株克罗诺杆菌食品分离菌株的成膜率为90.7%,并且温度对细菌成膜影响明显。四种毒力基因中,ompX检出率为100%;cpa检出率为13.9%;hly检出率为11.6%;sip基因未检出。耐药表型检测发现43株克罗诺杆菌食品分离菌株对青霉素、克林霉素、万古霉素、苯唑西林和杆菌肽B的耐药率为100%,对利福平的耐药率达97.7%;对红霉素的耐药率为7%;对环丙沙星、庆大霉素、四环素、氯霉素、亚胺培南、磺胺甲恶挫、呋喃妥因、头孢西丁、链霉素、阿米卡星、氧氟沙星等100%敏感。本研究表明克罗诺杆菌食品分离菌株具有较好的形成生物被膜能力,对常见的抗生素耐药率较高,并且分离菌株携带一定的毒力基因,对食品安全造成潜在威胁。     

大米浓缩蛋白酶法改性与功能性质评价

以大米浓缩蛋白（rice protein concentrate,RPC）为原料,利用碱性蛋白酶（Alcalase）改性。探讨了在最适条件下,即底物浓度5%、酶与底物比例0.8%、pH8.5、55℃,经过改性制得改性大米浓缩蛋白（modified rice protein concentrate,MRPC）的功能性质：氮溶性指数（NSI）为52.9%、乳化活性（EA=0.101）、乳化稳定性（ES=26.7%）、表面疏水性（2627.6）以及分子量分布。研究表明,经过Alcalase改性后的MRPC与大豆分离蛋白接近,具有作为食品蛋白质添加剂开发的潜力。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的：建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I（staphylococcal enterotoxin I,SEI）的双抗夹心酶联免疫吸附方法（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA）。方法：利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗兔IgG（IgG/HRP）的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、IgG/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果：抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x＋0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5 μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论：本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。     

传统发酵食品中乳酸菌的安全性评估

本文以传统发酵食品中分离的38株乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)为研究对象,利用溶血试验、明胶液化试验和吲哚试验测试受试菌株相关产毒代谢产物,采用K-B纸片法检测菌株对25种抗生素的耐药表型,运用聚合酶链式反应检测菌株携带的耐药基因。结果表明:38株乳酸菌的溶血试验、明胶液化试验和吲哚试验均为阴性,说明菌株在生长代谢过程中不产生相关毒力物质;38株菌对头孢曲松、头孢噻肟、四环素、多西环素、氯霉素、克林霉素和红霉素表现敏感;对其余18种抗生素呈不同程度耐受,其中对磺胺异噁唑耐药率最高(52.63%),其次是卡那霉素(34.21%)、万古霉素(31.58%)、阿米卡星(26.32%)、链霉素(15.79%)、利福平(2.63%);耐药谱分析受试大部分乳酸菌存在多重耐药现象;PCR共检测出3种耐药基因,分别是氯霉素耐药基因cat A(2.63%)、万古霉素耐药基因van A(5.26%)、利福平耐药基因rpo B(42.11%)。结果表明从传统发酵食品中分离的38株乳酸菌不存在相关产毒代谢产物安全隐患,但对部分抗生素呈现出不同程度耐受,并且利福平耐药基因rpo B的检出率较高。本研究为传统发酵食品中乳酸菌安全评价体系的完善提供理论参考。     

食品中沙门氏菌恒温隔绝式PCR检测方法的建立

为弥补传统培养方法耗时长和现场检测步骤繁琐等缺陷,该研究建立了一种针对食品中沙门氏菌的恒温隔绝式PCR快速检测方法。根据沙门氏菌的inv A基因设计特异性引物和探针,通过水浴法快速提取细菌DNA,优化引物、探针以及模板用量,建立了一种基于恒温隔绝式PCR快速检测沙门氏菌的方法,并对方法的特异性和灵敏度及稳定性进行评价,最后对比建立的方法与传统PCR方法、传统分离培养法对实际食品样品中沙门氏菌污染的检测效果。建立的恒温隔绝式PCR检测方法特异性好,灵敏度高且与其他细菌无交叉反应,最低检出限可达75 CFU/mL,可在6 h内完成检测实际食品样品中污染的沙门氏菌,传统PCR方法至少需12 h才能达到与之相同的检测效果,传统培养法验证了建立方法的准确性和可靠性。本研究建立的恒温隔绝式PCR方法更快速,且操作简便,适用于现场检测食品中污染的沙门氏菌。     

对提高实验教学质量的一些看法

针对实验教学中存在的问题,包括实验教学的地位没有得到足够重视,学生对实验课缺乏热情,学生对实验课的主观能动性差、无创新性,实验类型单一、内容简单等提出了一些个人看法,并进行了改良的实践探索.     

热诱导潜在食物中毒威胁源重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素去折叠及聚合过程

热失活工艺是降低加工食品中潜在的细菌和毒素含量的有效手段。M型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins M,SEM）归属于V型超抗原,具有较弱的催吐活性,是一种潜在的金黄色葡萄球菌所致食物中毒威胁源。本研究利用圆二色光谱、荧光光谱、变性/活性聚丙烯酰胺凝胶电泳监测重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素（recombinant staphylococcal enterotoxin M,rSEM）热诱导变性过程。结果表明,在低于40 ℃时,rSEM具有富含α-螺旋（17%）、β-折叠（32%）、转角（21%）的天然折叠态结构,分子表面唯一的121号色氨酸残基位于β-掌型结构域中相对疏水的环境中。随着温度从42 ℃升高到55 ℃,rSEM二级结构中减少的α-螺旋含量被增加的β-折叠/转角含量所弥补,蛋白质分子之间聚集状态未发生明显改变,最大荧光发射波长明显蓝移,同时350 nm和340 nm波长处的荧光强度比表现出反S型曲线,说明42～55 ℃温和加热可导致另一种形式的rSEM折叠中间态（intermediate state,IS）形成。在55～90 ℃温度范围内,rSEM二级结构基本维持稳定。与此同时,当加热温度从65 ℃升高至80 ℃时,350 nm与340 nm波长处的荧光发射强度比并未显示出蛋白处于完全变性状态,说明在加热过程中rSEM二级结构基本维持稳定,而三级结构具有较大动态变化的可能性,这可能与β-掌型结构域可以通过诱导契合结合具有不同构象的主要组织性相容复合体等位基因产物有关系。此外,在70 ℃乃至更高的温度,rSEM的聚集程度明显增加并且在90 ℃时达到最大。综上,rSEM中间态形成、聚合体产生以及稳定的β-折叠/转角结构是该蛋白在高温下依然保持热稳定性的基础。通过对rSEM热诱导去折叠过程的研究有助于阐明rSEM耐热机理,未来利用该方法对其他各类金葡菌肠毒素热失活机制进行类似研究将利于食品安全性生产工艺过程的改善。     

恒温隔绝式聚合酶链式反应检测食品中金黄色葡萄球菌

建立一种恒温隔绝式聚合酶链式反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)检测食品中金黄色葡萄球菌的方法.根据nuc基因设计特异性引物、探针,并探索针对食品样品快速提取金黄色葡萄球菌模板DNA的方法;通过优化引物、探针及模板的用量,对iiPCR的特异性、...