烟草基因组知识篇:3.基因组注释

<正>在完成序列的拼接后,得到的是很长的DNA序列、甚至可能是整个基因组的序列。这些序列中包含许多未知的基因,将基因从这些序列中找出来是基因组注释的主要内容。基因组DNA序列可分为两大部分:基因及其相关序列、基因间序列。以起始密码子开始、终止密码子结束、称之为开放阅读框(open readingframe,ORF)的序列为基因序列,它们可编码蛋白质和RNA(非编码RNA),所以又称为编码序列;基因相关序列包括拟(假)基因(pseudogene)、基因片段、内含子、非翻译区(untranslated region,UTR)等[1]。基因间序列主要是一些重复序列,它们是所有基因组尤其是真核生物基因组共同的重要特征。     

烤烟新品种中烟特香301的选育及特征特性

中烟特香301是利用0.6%EMS浸泡诱变中烟100种子,以特征香韵为育种目标,通过系谱法定向选择,经过连续多代自交培育而成的花香香韵烤烟新品种,2020年9月通过全国烟草品种审定委员会审定。品种试验结果显示,中烟特香301田间前期生长势中等、后期逐渐变强,腰叶偏窄长、主茎粗壮,综合经济性状优于中烟100;抗病性鉴定结果显示,中烟特香301抗赤星病、中抗TMV和黑胫病,适宜在黄淮区、西南区、华中区等中等以上肥力烟田种植;烟叶品质评价结果显示,中烟特香301油分指标优于中烟100,还原糖、总糖含量及糖碱比等指标高于中烟100,感官质量平均分值高于中烟100,具有独特的（玫瑰）花香香韵风格。中烟特香301既丰富了烤烟的香韵风格,又提升了烟叶品质,同时兼顾了经济性状和抗病性,实现了预期育种目标。     

白肋烟晾制过程中叶片组织结构变化的研究

木文对白肋烟晾制过程中叶片组织结构变化进行了研究。结果表明，随着晾制的进行，白肋烟叶片厚度逐渐变薄，并且此变薄的隔度以变色期（变黄、变褐）最大，占总变薄厚度的８０．８％。同样，栅栏组织和海绵幻织厚度也逐渐收缩变薄，并且在普通显微镜下观察栅栏组织和海绵组织细胞在变褐之前清晰可辨，但变褐之后就很难辨别，褐变是叶肉细胞破裂溶解的外观表征。     

白肋烟晾制过程中烟叶外观变化与内在变化关系的研究

对白肋烟晾制过程中烟叶外观变化与内在变化关系进行了研究。结果表明,烟叶的干物质和总糖、总氮等化学成分在凋萎期、变黄期减少较多;变褐期和凋萎期是叶片失水的主要阶段;变褐是叶片细胞发生破裂溶解而消失的外观表征,变褐期叶片变薄程度最大。     

烟草T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法的筛选与优化

烟草T-DNA激活标签插入突变体库的创制过程中,需要进行大量的T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,因此选择一种适用于烟草T-DNA侧翼序列扩增的高效方法尤为必要。本研究比较了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三种方法对T-DNA插入位点侧翼序列的扩增效率、插入位点确定的比例和同源蛋白比对结果,并对3种方法的PCR程序、体系和引物设计等方面进行了优化,确定TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增,通过产率、条带长度、插入位点和同源蛋白比对结果的比较,得出TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增。这一结果为应用烟草突变体开展烟草基因功能的研究奠定了基础。     

基于EST序列的烟草cSNP发掘

SNP标记是一类应用广泛的第三代分子标记。从GenBank下载普通烟草EST序列共计317 175条,用CAP3软件对序列进行拼接。设定SNP位点的冗余度大于2,采用AutoSNP软件检测cSNP。结合位点所在序列的文库和品种信息以及多个SNP位点的共分离分值来评价其可信度。结果表明,317 175条普通烟草EST拼接成重叠群中15 429个重叠群至少包含4个读长,鉴定出53 477个冗余度大于2的候选SNP,烟草中出现SNP的频率为0.34%。其中SNP的转换率大于颠换,插入/删除表现出A/T偏好。这些高质量SNP标记的发掘为开展烟草基因功能研究和分子育种奠定了良好的基础。     

烟草重要基因篇:7.烟草多药和有毒化合物排出基因

<正>多药和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)基因编码的蛋白是一类依靠Na+/H+跨膜电化学势转运底物的次级转运蛋白,对金属离子、次级代谢产物、抗生素及多种药物有转运作用。MATE是一个多基因家族,该家族成员最先在细菌中报道,此后真菌、动物和植物中也陆续有MATE基因得到鉴定。植物MATE家族成员主要参与金属离子、毒素物质和次级代谢产物的运输,进而在抗逆和     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

烟草TILLING技术体系的建立及NtPhyB基因的筛选

定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING）是一种新近发展起来的高通量检测点突变的反向遗传学方法。本研究首次将TILLING技术用于EMS处理的烟草突变体筛选中,通过对正反向荧光引物使用量的摸索,确定了10 μL PCR体系中IRDye-700标记的正向引物（1 μM）适用量为0.32～0.64 μL,IRDye-800标记的反向引物（1 μM）适用量1.12～1.6 μL;对异源双链CEL Ⅰ酶切体系实验表明,10 μL PCR产物中加入0.6 μL CEL I酶,1.5 μL 10× Buffer酶切效果最好。从而建立并优化了适用于普通烟草基因组研究的TILLING技术体系。在此基础上,以NtPhyB为目标基因,在1000份0.6% EMS诱变的M2突变体中进行筛选,共得到13个突变体,该基因突变频率约为1/94 kb。本试验建立的TILLING筛选体系能够快速、高效地筛选任意已知序列基因的突变体,对烟草功能基因组研究具有重要意义。