环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase）催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G）的效果，用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1，经亲和纯化柱纯化并浓缩后，测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,VC)和β-环糊精为底物，酶法合成AA-2G，并通过单因素优化实验，进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响，对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明：此酶具有合成AA-2G的能力，未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后，考虑到低成本和经济效益，选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体，当糖基供体为可溶性淀粉时，底物浓度为70 g/L，反应pH4.5，反应温度37℃，底物比例3/3(VC/糖基供体)，蛋白浓度5.0 mg/mL，反应时间为42 h时，该重组CGTase催化合成AA-2G...     

易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）,使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。