应用熏烟联合脂多糖方法建立慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压小鼠模型

目的建立一种慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压（COPD—PAH）小鼠模型。方法模型组小鼠第1天和第14天鼻内滴注脂多糖（LPS）,其余时间每天熏烟4h,上下午各2h,10支香烟／h,6d／周,持续熏烟3个月。对照组小鼠不做任何干预。建模期间监测小鼠体质量变化。建模结束后,检测以下指标：肺功能和右心压力;小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数和细胞类型;用EI,ISA方法检测肺组织中细胞因子KC和黏蛋白MucSac的水平。并观察气道和肺组织病理改变。结果与对照组相比,模型组小鼠体质量和动态肺顺应性显著降低,吸气阻力、右心室平均压和右心室重量／体质量比等显著增加。模型小鼠支气管肺泡灌洗液中自细胞总数升高,以巨噬细胞为主,并伴随中性粒细胞明显增加。肺组织KC和Muc5ac蛋白均较对照组明显增多。肺组织切片PAS染色显示模型组杯状细胞增生。此外,在模型组小鼠肺切片中观察到炎症浸润,气管壁和肺小血管壁平滑肌增厚,气管基底层下胶原沉积,提示气管和肺血管重塑的发生。结论用这种熏烟结合气道内滴注LPS的方法可以在短期内建立COPD-PAH小鼠模型。     

网/腹膜乳斑的巨噬细胞表型与结直肠癌分期的关系

【摘要】 目的 探讨不同分期结直肠癌网/腹膜乳斑巨噬细胞的表型及作用。 方法 收集番禺中心医院普外科2011年1月至2012年12月不同分期结直肠癌患者网/腹膜乳斑标本60例及正常人网/腹膜乳斑标本10例。分离培养巨噬细胞,通过CD68免疫荧光染色、流式细胞术(FCM)鉴定网/腹膜乳斑巨噬细胞表型,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测网/腹膜乳斑巨噬细胞IL-10、IL-12的分泌情况。结果 对照组、T1-3期组网/腹膜乳斑M1型巨噬细胞数量明显高于T4期组(P均<0.01);T4期组M2型巨噬细胞数量则明显高于对照组及T1-3期组(P均<0.01)。网/腹膜M1型巨噬细胞与结直肠癌T分期呈负相关(P<0.01),而M2型巨噬细胞的表达则与结直肠癌T分期呈正相关(P<0.01)。各组不同时点网/腹膜乳斑巨噬细胞IL-10、IL-12的分泌有显著差异:对照组及T1-3期组IL-10均低于T4期组,而L-12则均高于T4期组(P均<0.05);乳斑巨噬细胞IL-12的分泌与结直肠癌T分期呈负相关(P均<0.01),而IL-10的分泌则与结直肠癌T分期呈正相关(P<0.01)。结直肠癌网/腹膜乳斑巨噬细胞表型与临床分期特别是浆膜是否受到肿瘤侵犯、淋巴结有否转移有关(P<0.05),而与肿瘤直径及分化程度无关(P>0.05)。 结论 网/腹膜乳斑巨噬细胞表型表达主要受浆膜是否受到肿瘤侵犯和淋巴结有否转移两方面因素影响;T1-3期结直肠癌患者,网/腹膜乳斑巨噬细胞以M1型为主,对肿瘤细胞起捕获和杀灭作用;T4期结直肠癌患者,网/腹膜乳斑巨噬细胞以M2型为主,对肿瘤生长起促进作用。     

丹参酮ⅡA磺酸钠抑制低氧性肺动脉高压大鼠模型白细胞介素6的表达

目的 研究丹参酮ⅡA磺酸钠对低氧性肺动脉高压大鼠模型白细胞介素6(IL-6)表达的影响.方法 将SD大鼠(n=32)按随机数字表法分为常氧对照组(A组)、缺氧模型组(B组)、丹参酮ⅡA磺酸钠低剂量(10 mg·kg- 1·d-1)干预组(C组),丹参酮ⅡA磺酸钠高剂量(30 mg·kg-11·d -1)干预组(D组),每组8只.将A组置于常氧中饲养,而B组、C组和D组大鼠则置于常压低氧舱中,低氧舱内氧浓度控制在(10±1)％.C组和D组从缺氧第1天开始,分别每天腹腔注射10 mg/kg、30 mg/kg的丹参酮ⅡA磺酸钠,A组和R组腹腔注射相同容积的生理盐水.连续饲养21d后,右心测压法检测各组大鼠的右心室收缩压及平均动脉压;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠肺小动脉血管形态及炎性反应的组织学变化;ELISA法检测血清的IL-6含量;实时荧光定量PCR法检测肺组织中IL-6的基因表达.结果 低氧明显诱导了大鼠平均动脉压及右心室收缩压的升高,而经过丹参酮ⅡA磺酸钠干预后,这种升高显著降低,A、B、C、D各组大鼠的平均动脉压分别为(12.922±0.442) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、(26.737±2.222) mm Hg、( 19.948± 1.681) mm Hg及(18.547±1.090) mm Hg,右心室收缩压分别为(24.677±1.725)mm H g、(63.675±5.283) mm Hg、(49.250±3.816) mm Hg及(41.839±3.993)mm Hg.丹参酮ⅡA磺酸钠改善了低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉血管形态改变及炎性反应,与B组相比,C、D组的肺小动脉管壁和平滑肌层增厚减轻,管腔狭窄及血管周围仅见少量的淋巴细胞及中性粒细胞浸润,但与A组相比,炎性反应仍明显.低氧诱导后,B组IL-6含量较A组明显升高(P＜0.05),丹参酮ⅡA磺酸钠处理后,C、D两组的IIL-6含量较A、B组均降低(均P＜0.05),且C组IL-6含量高于D组(P＜0.05).低氧明显诱导了肺组织中IL-6 mRNA的表达,丹参酮ⅡA磺酸钠则明显抑制低氧大鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达水平,但仍高于常氧对照组,即B组＞C组＞D组＞A组(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA磺酸钠可以有效治疗低氧引起的慢性肺动脉高压,可能与其对IL-6的抑制作用有关.     

大鼠肺动脉和主动脉成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究

目的 建立大鼠肺动脉和主动脉外膜成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的方法,并对其细胞形态和成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的特征进行观察.方法 通过精分肺动脉和主动脉,剥取外膜,用10％的胎牛血清低糖DMEM培养基诱导细胞爬出生长.倒置显微镜下观察成纤维细胞形态,并对细胞进行免疫荧光鉴定.通过对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的观察确定传代细胞是否转化为肌成纤维细胞.结果 成纤维细胞能够迅速从剥取的外膜中爬出生长,波形蛋白细胞免疫荧光染色为阳性.主动脉成纤维细胞和肺动脉成纤维细胞形态差别大,前者为铺路石状,后者呈细长梭形.2种成纤维细胞经传代皆能转化为肌成纤维细胞,免疫荧光染色可见α-SMA大量表达,前者包围着细胞核呈条索状非定向分布,后者平行于细胞长轴呈细丝状表达.结论 该方法所获得的成纤维细胞纯度高,可在体外稳定培养.本研究首次发现了肺动脉和主动脉成纤维细胞形态学及生物行为上的差别,为细胞水平研究主动脉和肺动脉血管重塑,胶原沉积等相同或不同的病理机制提供了充足可靠的靶细胞模型.     

一种大鼠肺静脉平滑肌细胞快速培养方法的建立及评价

目的 通过改进原代大鼠肺静脉平滑肌细胞(pulmonary vein smooth muscle cells,PVSMCs)的培养方案,以期建立快速、方便、高细胞活力的肺静脉平滑肌细胞培养方法,为肺静脉在肺血管相关疾病研究中提供适合的细胞模型.方法 体视镜下显微分离大鼠肺静脉,胶原酶消化后获取原代PVSMCs,分别用低糖DMEM培养基、DMEM-F12培养基、高糖DMEM培养基作为培养液,观察PVSMCs的生长情况和细胞形态,对平滑肌α-actin进行免疫荧光鉴定,并用实时荧光法检测PVSMCs对高钾溶液引起的细胞内钙浓度升高的反应,评价细胞活力.结果 PVSMCs在3种培养基中的生长速率比较:DMEM-F12＞高糖DMEM＞低糖DMEM.DMEM-F12中培养的PVSMCs可见细胞质中有典型的、并行排列的、绿色荧光显色的平滑肌α-actin蛋白,细胞核呈蓝色荧光,细胞纯度达95％以上,而阴性对照只见染蓝光的细胞核.细胞对高钾溶液具有良好反应.结论 DMEM-F12培养基中PVSMCs生长速率最大,细胞符合平滑肌细胞免疫结构特征,并具有良好的细胞功能.DMEM-F12培养基更适合PVSMCs的培养.     

钙池操纵性钙内流及经典瞬时受体电位蛋白和瞬时受体电位香草酸蛋白在大鼠远端肺静脉平滑肌上的表达

本研究旨在通过观察远端肺静脉上经典瞬时受体电位(TRPC)通道蛋白和瞬时受体电位香草酸(TRPV)通道蛋白的表达以及钙池操纵性钙内流(SOCE)的水平,探讨慢性低氧对肺静脉平滑肌的影响,从而研究肺静脉平滑肌在低氧性肺动脉高压发病中的作用及其机制.慢性低氧可造成肺动脉和肺静脉的收缩和血管重塑,其中慢性低氧对肺动脉的影响已得到深入的研究,但针对肺静脉的研究目前尚未获得重视.我们的前期研究结果显示,SOCE是低氧性肺动脉高压时肺动脉平滑肌细胞内钙离子失衡的主要原因,并可引起肺动脉收缩和血管重塑.钙池操纵性钙离子通道(SOCC)是一种钙离子通道,主要由瞬时受体电位通道蛋白构成.     

全自动缺氧动物模型饲养箱的研制和应用

目的 为建立符合低氧性肺动脉高压(CHPH)的实验动物模型,设计制造全自动控制的常压持续性低氧动物饲养舱.方法 ①将氧气浓度控制系统、箱体换气系统、低氧报警系统及缺氧箱箱体系统四个相互独立的功能系统进行有机整合,通过软件程序的集成控制,制作一种自动化程度高,操作简单,实验成本低,系统稳定的全自动缺氧动物培养箱,通过设定使箱体氧浓度稳定在10％左右,箱体内其他指标符合国家SPF动物饲养标准.②10只SD大鼠随机分为低氧组和常氧对照组,每组各5只.低氧组大鼠饲养于全自动动物模型饲养箱,设定好参数,低氧箱放置于SPF环境内,饲养三周.常氧对照组大鼠置于同一间SPF动物房内给予相同饮食饲养,观测大鼠体质量、平均右心室压(MRVP)、右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚指数[RV/(LV-S)],并观测肺血管病理学改变.结果 缺氧组大鼠体质量增长缓慢,MRVP、RVSP、RV/(LV+S)明显高于对照组(P＜0.01).肺组织病理检查示缺氧组大鼠肺内血管管壁明显增厚.结论 研制的缺氧动物模型饲养箱自动化程度高,应用方便,调节灵活,结构简单,性能稳定,低成本,易操作.能复制出比较符合CHPH病理生理变化特征的大鼠模型,并能满足其他缺氧性动物实验的需要.