子痫前期肾素血管紧张素系统基因多态性及其相互作用的相关性研究

目的 探讨血管紧张素转换酶（ACE）基因插入／缺失（I/D），血管紧张素原（AGT）基因M235T，血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）基因A1166C位点多态性与子痫前期发病的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）方法检测58例子痫前期孕妇，102例正常妊娠孕妇的ACEI／D，ACTM235T，AT1RA1166C位点多态性。结果 子痫前期组ACEDD型占48．3％（P〈0．05，优势比[OR]2．04），Ⅱ型占8．6％（OR0．34），子痫前期组与对照组相比D等位基因频率显著增加（P〈0．01，OR1．9）。AGTM235T，AT1RA1166C多态性与子痫前期无明显相关。子痫前期三个基因的基因型之间无明显协同作用。结论 ACEDD型可能增加妊娠期高血压疾病患病风险，ACEI／D，AGTM235T，AT1RA1166C多态性在子痫前期发病危险性上无明显协同作用。     

产ESBLs大肠埃希菌CTX—M型耐药基因分析

目的了解某院CTX-M型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）在大肠埃希菌中的检出率，并确定其基因型。方法对该院2005年1—12月临床送检标本中分离的197株大肠埃希菌进行ESBLs表型确证试验和接合试验；采用聚合酶链反应（PCR）检测CTX-M酶基因型，对PCR产物测序并确定其基因型。结果197株大肠埃希菌中有104株（52．79％）ESBLs表型检测阳性，其中91株符合供体菌标准，64株（70．33％）接合成功，接合子均确证产ESBLS。PCR扩增结果示104株产ESBLs大肠埃希菌中共有98株（94．23％）携带CTX-M型基因，其中38株（36．54％）检出blaCTX-M-1组基因，69株（66．35％）检出blaCTX-M-9组基因。64株接合子中共有51株（79．69％）携带CTX-M型基因，其中18株（28．13％）检出blaCTX-M-1组基因，35株（54．69％）检出blaCTX-M-9组基因。基因测序确定存在CTX-M-22、CTX-M-28、CTX-M-15、CTX-M-14、CTX-M-27五种基因亚型，以CTX-M-14为主。结论该院大肠埃希菌产ESBLs和耐药质粒水平传播情况严重，产ESBLs细菌基因型以CTX-M-9组的CTX-M-14亚型为主，同时存在CTX-M-22、CTX-M-28、CTX-M-15和CTX-M-27等多种亚型。     

昆明地区原因不明复发性流产妇女与HLA—G14bp基因多态性相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen，HLA）3’非编码区（UTR）14bp基因多态性与原因不明复发性自然流产的相关性。方法对原因不明复发性流产患者26例和正常妊娠妇女51例静脉采血，提取DNA。用PCR方法检测HLA—G 14bp基因多态性。结果-14bp／-14bp缺失纯合子、＋14bp／＋14bp插入纯合子、-14bp／＋14bp缺失／插入杂合子基因型在两组间分布差异无显著意义；一14bp和＋14bp等位基因频率在两组间也无显著型差异。结论昆明地区部分原因不明复发性流产患者的病因与HLA—G 14bp基因多态性可能无直接相关性。     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及其基因分析

目的了解临术分离菌中产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌发生率，分析其耐药表型，探讨其ESBLs基因类别。方法采用美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的纸片扩散法，对364株大肠埃希菌和71株肺炎克雷伯菌进行产ESBLs菌株初筛试验，并用双纸片确证试验和双纸片协同试验进行产ESBLs菌株确证。按照NCCLS文件标准，用Kirby-Bauer纸片扩散法进行产ESBLs株21种抗生素药敏试验。用PCR方法扩增168株ESBLs表型阳性菌中blaTEM-1、blaSHV-1、CTX-M-1组、TOHO-1组等4种基因。结果（1）大肠埃希菌和克雷伯菌中产ESBLs的检出率分别为46．7％和32．4％。（2）产ESBLs菌对青霉素类100％耐药；对第1、2代头孢菌素耐药率达85％～100％；对除头孢他定以外的第3代头孢菌素，产ESBLs大肠埃希菌耐药率为80％以上，产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药率为65％～75％以上；产ESBLs菌对复方新诺明的耐药率为75％～85％；产ESBLs大肠埃希菌对环丙沙星耐药率为80％～90％、庆大霉素耐药率为50％～75％；产ESBLs菌对阿米卡星、头孢替坦、亚胺培南有较好的敏感性（80％～90％以上）。（3）产ES-BLs大肠埃希菌中，blaTEM-1、blasSHV-1、CTX-M-1组等3种基因扩增阳性率分别为93．9％、7．4％和53．4％。51．4％的菌株同时携带2种耐药基因，2．7％的菌株同时携带3种耐药基因。产ESBLs肺炎克雷伯菌中blatTEM-1、blaSHV-1、CTX-M-1组等3种基因扩增阳性率分别为50．0％、95．0％和20．0％。同时携带2种耐药基因的菌株占35．0%，同时携带3种耐药基因的菌株占15．0％。两种细菌中均未检出TOHO-1组基因。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产ESBLs的检出率较高，大肠埃希菌中产ESBLs菌比例有逐年上升趋势。产ESBLs菌对头孢噻肟的耐药率远高于头孢他定，且多数菌株对青霉素类，第1、2、3代头孢菌素、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖甙类等抗生素呈多重耐药。大肠埃希菌中以TEM型和CTX-M型基因为主。肺炎克雷伯菌以SHV型基因为主，同时存在TEM型和CTX-M型基因。     

熔解曲线分析检测临床常见4种革兰阳性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌,为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息.方法 选取临床最常见的革兰阳性病原菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种.根据检测菌种的不同,分别选取不同菌种的特异性靶序列,设计种特异性引物.对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序,验证引物的特异性.对目标菌种引物进行荧光PCR预实验,筛选Tm值差异较大的多对引物,进行熔解曲线分析法实验,并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化.对优化后的熔解曲线法进行特异性验证.通过检测加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析.应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株,分析每种菌种的熔解曲线图,熔点温度(Tm值)及其标准差(SD)的变化,评价所构建方法的稳定性.结果 ①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示,目标菌株均有目的特异性扩增产物,非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特异性电泳条带.特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符.②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条件优化结果:预变性温度94℃、120s,变性温度94℃、20s:退火温度53℃、12s;延伸温度68℃、13s;扩增循环数为40个循环,熔解曲线分析温度75℃～95℃.最佳的引物浓度为300nmol/L.③所建立的方法经特异性分析显示,上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为81.02℃;80.32℃;82.37℃:83.10℃,峰高(cm)/峰宽(cm)均大于2.6,以此为典型的熔解曲线判断标准,则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线.④方法的敏感性分析显示,上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为:550、520、470、500与203CFU/mL.⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测,结果显示,其平均Tm值依次为(80.96±0.688)℃,(80.20±0.729)℃,(82.42±0.599)℃,(83.20±0.713)℃和(80.11±0.15)℃.结论 本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和mecA基因检测引物具有较好的菌种特异性,可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建立;所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测;但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近,必要时,可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种.     

熔解曲线分析检测临床常见3种革兰阴性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测临床常见3种革兰阴性病原菌.方法 选取临床常见的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌作为本课题研究的检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果 (1)特异性验证结果显示,目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为88.37℃; 86.32℃; 80.86℃; (2)敏感性分析结果显示,3种目标菌可检测到的拷贝浓度稀释液依次为:1.34×103拷贝/ml,3.67×103拷贝/ml,3.01×103拷贝/ml; (3)稳定性评价的结果显示,3种目标菌其平均Tm值依次为88.54±0.662; 86.38±0.727;80.12±0.607.结论 所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测.     

3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较

目的寻找一种简单、有效的提取临床菌血症样本细菌DNA的方法．方法分别用碱液加热裂解法、溶菌酶法和商品DNA提取液法提取细菌DNA,用临床常见病原菌特异性引物,进行PCR扩增．结果（1）商品DNA提取液法提取革兰阴性菌DNA,经PCR扩增后得到特异性目的片段,但未扩增出革兰阳性菌的特异性目的片段;（2）碱液加热裂解法、溶菌酶法提取革兰阴、阳性菌DNA,经PCR扩增后均得到特异性目的片段,但碱液加热裂解法比溶菌酶法能扩增到更低浓度的细菌DNA目的片段．结论碱液加热裂解法是3种方法中最简单有效的细菌DNA提取方法,适用于临床病原菌基因组DNA提取．     

云南汉族eNOS/ET-2基因多态性与高血压的相关性研究

目的探讨eNOS、ET-2基因多态性与高血压的相关性。方法采用病例-对照相关性研究策略,选择三代居住在云南的汉族作为研究对象,用基因芯片检测技术,对100例高血压患者及97例健康对照者进行eNOS Glu298Asp(EE、ED、DD)、ET-2A985G(AA、AG、GG)位点基因多态性检测。用OddRatio估计相对危险度。结果云南汉族97例健康人群中:(1)eNOS Glu298Asp位点的EE、ED、DD基因型频率分别是0.845、0.144、0.011;E和D等位基因频率分别是0.918、0.082。(2)ET-2A985G位点的AA、AG、GG基因型频率分别是0.020、0.258、0.722;A和G等位基因频率分别是0.149、0.851。(3)云南汉族100例高血压患者中,ET-2A985G(AA、AG、GG)位点基因型多态性频率与对照组比较,差异无统计学意义。但ET-2A985G位点G等位基因频率(0.925)与对照组(0.851)比较,差异有统计学意义(χ2=5.507、P=0.019),Odd Ratio=2.168(95%CI:1.123～4.184)。(4)eNOS Glu298Asp位点的DD基因型频率(0.01)与对照组(0.01)比较,差异无统计学意义。结论云南汉族中eNOS Glu298Asp突变对高血压的发生意义不大。ET-2A985G等位基因可能与高血压的易感性相关。     

云南汉族RAS系统基因多态性与高血压病的相关性研究

目的探讨中AGT、ACE基因多态性与高血压病的相关性。方法采用病例-对照相关性研究策略,选择三代居住云南的汉族作为研究对象,用基因芯片检测技术,对100例高血压病患者及97例健康对照者进行AGT M235T(MM、MT、TT)、ACEI/D(Ⅱ、ID、DD)位点基因多态性检测。用Odd Ratio估计相对危险度。结果1、云南汉族97例健康人群中(1)AGT M235T位点的MM、MT、TT基因型频率分别是0.052、0.381、0.567;M和T的等位基因频率分别是0.242、0.758。(2)ACEI/D突变的Ⅱ、ID、DD基因型频率分别为0.340、0.598、0.062;I和D等位基因频率分别是0.680、0.320。2、云南汉族100例高血压病患者中,AGT M235T(MM、MT、TT)、ACEI/D(Ⅱ、ID、DD)位点的基因型多态性频率与对照组比较,差异无显著性意义。结论云南汉族健康人群AGT M235T、ACEI/D基因多态性可能在高血压病发生中不起直接作用。     

ANP和NPR-C基因多态性与高血压病的相关性研究

目的 探讨ANP和NPR-C基因多态性与高血压病的相关性.方法 用病例-对照相关性研究,选择3代居住云南的汉族为研究对象,用基因芯片技术,对100例高血压病患者及97例健康对照者进行ANP T2238C和NPR-C A-55C位点基因多态性分析.结果 (1)云南汉族97例健康人群中ANP T2238C位点的TT、TC基因型频率分别是0.959、0.041,未检出CC基因型;T和C等位基因频率分别是0.979、0.021.(2)NPR-C A-55C的AC、CC基因型频率分别是0.763、0.237,未检出AA基因型;A和C等位基因频率分别是0.381、0.619.(3)ANP T2238C(TT、TC、CC)基因型多态性频率与对照组比较,差异无显著性意义.(4)NPR-C A-55C位点的CC基因型频率(0.540)与对照组(0.237)比较差异有极显著性意义(χ2=18.973,P=0 000),OR=3.777 (95% CI:2.050～6.960).结论 云南汉族NPR-C A-55C CC基因型可能与高血压病易感性相关.