靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合体抗原受体慢病毒载体构建及病毒包装滴定的实验研究

目的 构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3,GPC3)的慢病毒载体,并进行慢病毒载体的鉴定、包装及病毒滴度测定.方法 设计靶向GPC3抗原的嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)分子重组基因及特异性引物,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对CAR分子重组基因进行体外扩增及PCR反应片段搭桥,双酶切后定向插入到pCDH质粒,构建pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,经菌落PCR、DNA凝胶电泳及测序鉴定.将目的 质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集上清液按不同比例稀释后感染293T细胞,流式细胞术检测anti-GPC3-CAR表达并计算病毒滴度.结果 经菌落PCR及测序证实,正确构建重组慢病毒载体pCDH-anti-GPC3-CAR,包装后的病毒滴度为(1.50～3.24)×106 TU/ml.结论 本研究成功构建携带不同共刺激分子的pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,可在293T细胞中表达并产毒,为后续构建CAR免疫细胞提供技术储备.     

干扰素α和胸腺五肽协同干预对HepG2.2.15细胞APOBEC3A和APOBEC3B mRNA表达的影响

目的探讨IFNα和胸腺五肽(TP5)协同干预对HepG2.2.15细胞载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A)、APOBEC3B基因mRNA表达水平的影响。方法将HepG2.2.15细胞分为空白对照组、IFN处理组、TP5处理组和IFNα联合TP5组,在处理的12、24、48和72 h用实时荧光定量PCR方法检测细胞APOBEC3A、APOBEC3B基因mRNA表达水平。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果与空白对照组相比,IFNα、IFNα联合TP5分别处理12、24、48和72 h后,APOBEC3A mRNA的表达水平显著提高,差异均有统计学意义(P值均<0.001)。与IFNα处理组相比,4个时间点IFNα联合TP5组APOBEC3A mRNA的表达水平显著提高,差异均有统计学意义(P值<0.001)。TP5处理在各时间点对APOBEC3A mRNA表达水平的影响差异无统计学意义(P值均>0.05)。与对照组相比,所有处理组中APOBEC3B的mRNA表达水平差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论IFNα联合TP5处理可显著上调HepG2.2.15细胞中APOBEC3A mRNA的表达水平。