实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞癌中删基因的表达

目的探讨PTCH基因在肝细胞癌组织中的表达及其与肝癌病理分级的关系。方法提取手术切除18例不同病理分级的人肝癌、癌旁组织和6例胆管结石手术切除的正常肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量RT-PCR法观察人肝细胞癌组织与癌旁组织中PTCH基因的相对表达水平,以及观察人正常肝组织中PTCH基因的表达水平。结果PTCH在所测18例肝细胞癌组织与癌旁组织中均有表达,在6例正常肝组织中不表达，且在病理分级为Ⅰ和Ⅱ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P〈0．01），而在病例分级为Ⅲ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P=0．024）。结论随着肝癌恶性程度的增加PTCH的mRNA表达量呈递减趋势，提示PTCH可能参与了肝细胞的早期癌变过程。     

实时荧光定量PT-PCR检测肝细胞癌中PTCH基因的表达

目的 探讨PTCH基因在肝细胞癌组织中的表达及其与肝癌病理分级的关系.方法 提取手术切除18例不同病理分级的人肝癌、癌旁组织和6例胆管结石手术切除的正常肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA.应用实时荧光定量RT-PCR法观察人肝细胞癌组织与癌旁组织中PTCH基因的相对表达水平,以及观察人正常肝组织中PTCH基因的表达水平.结果 PTCH在所测18例肝细胞癌组织与癌旁组织中均有表达,在6例正常肝组织中不表达,且在病理分级为Ⅰ和Ⅱ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),而在病例分级为Ⅲ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著低于癌旁组织(P=0.024).结论 随着肝癌恶性程度的增加PTCT的mRNA表达量呈递减趋势,提示PTCH可能参与了肝细胞的早期癌变过程.     

自体骨髓间质干细胞对异基因小鼠皮肤移植免疫排斥的影响

目的 观察自体骨髓间质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)对异基因小鼠皮肤移植的影响.方法 建立C57BL/6至BALB/c小鼠皮肤移植急性排斥模型,密度梯度离心法分离与贴壁法富集BALB/c小鼠BMSCs,自尾静脉输注.实验分3组,每组10只小鼠.A组:正常BALB/c小鼠+自体BMSCs,B组:仅行皮肤移植,C组:皮肤移植后BALB/c小鼠+自体BMSCs.检测各时间段皮肤组织病理表现以及相关细胞因子浓度变化.结果 由密度梯度离心法与贴壁法分离的细胞具有BMSCs的一般特征,C组较B组移植后皮肤免疫排斥反应明显减轻,IL-2、IFN-γ等细胞因子浓度在术后第7天(F=248 954.6,P＜0.05;F=148 311.7,P＜0.05)、第14天(F=117 372.3,P＜0.05:F=126 743.3,P＜0.05)均有降低.结论 异基因小鼠皮肤移植术后输注自体BMSCs可以抑制免疫排斥反应,其机制可能与减少IL-2、IFN-γ等相关细胞因子分泌有关.     

内皮素-1与肿瘤血管生成的关系

内皮素-1是一种血管收缩因子，近期研究发现肿瘤细胞和血管内皮细胞可以分泌内皮素-1，促使这些细胞增殖、迁移，抑制其凋亡，并通过促进VEGF分泌，协同作用于肿瘤血管生成。因此，内皮素-1被认为是一种新型血管生长因子，抑制内皮素-1的治疗可以在抗肿瘤血管生成中发挥一定的作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ和PTEN在肝癌组织中的表达及意义

目的检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和PTEN蛋白在肝癌组织与癌旁组织的表达情况,探讨两种蛋白表达㈦临床病理各参数的关系及意义。方法收集100例中山大学附属第一医院手术切除的肝癌㈦癌旁组织标本,构建组织微阵列芯片,应⒚免疫组化染色检测PPARγ和PTEN蛋白的表达。在体外实验中,应用Western blotting法检测人肝癌Huh7细胞中PPARγ活化对PTEN蛋白的影响。结果PPARγ、PTEN蛋白在肝癌组织中阳性表达率分别为82%和62%,明显低于癌旁组织的表达率(分别为95%和92%),差异有统计学意义(P0.05)。肝癌组织中PPARγ蛋白的表达与癌组织的分化程度密切相关,PTEN蛋白表达与癌组织的分化程度和肿瘤门静脉浸润关系密切。体外实验证实Huh7细胞中PPARγ活化后上调PTEN蛋白表达。结论PPARγ和PTEN蛋白在肝癌组织中阳性表达率均低于癌旁组织,PPARγ活化后上调PTEN蛋白表达,两种蛋白在肝癌发生发展中起着重要作用。     

大鼠肝移植术后受体骨髓间充质干细胞输注肝内示踪与标记方法比较

目的采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester,CFSE）与溴化脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）两种细胞标记物观测肝移植术后受体骨髓间充质干细胞（MSCs）肝内分布情况,并对两种方法进行比较。方法在已构建的DA-Lewis大鼠原位肝移植模型及提取培养Lewis大鼠MSCs的基础上分别用CFSE和Brdu对Lewis来源的MSCs进行标记．术中经门静脉输注．通过荧光显微镜和免疫组织化学法观测术后2mo内各时间点受体肝组织内MSCs的分布情况。结果CFSE细胞标记率约为（94．1±1．4）％。受体肝组织第1、7、14天内有CFSE标记的MSCs聚集,对照组第5天肝组织内发布的CFSE标记MSCs消失。Brdu细胞标记率约为（90．3±3．5）％。受体肝组织第14天、1个月、2个月可见Brdu阳性的MSCs分布,对照组相应时间点肝组织内未发现Brdu阳性的MSCs。结论CFSE和Brdu均为MSCs的良好标记物。CFSE标记细胞后荧光迅速减弱,适用于短期示踪。Brdu标记细胞后可维持较长时间．适用于长期示踪。两种标记方法均是MSCs较为简单有效的方法,实验显示受体MSCs大部分分布于移植肝脏。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞癌中删基因的表达

目的探讨PTCH基因在肝细胞癌组织中的表达及其与肝癌病理分级的关系。方法提取手术切除18例不同病理分级的人肝癌、癌旁组织和6例胆管结石手术切除的正常肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量RT-PCR法观察人肝细胞癌组织与癌旁组织中PTCH基因的相对表达水平,以及观察人正常肝组织中PTCH基因的表达水平。结果PTCH在所测18例肝细胞癌组织与癌旁组织中均有表达,在6例正常肝组织中不表达，且在病理分级为Ⅰ和Ⅱ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P〈0．01），而在病例分级为Ⅲ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P=0．024）。结论随着肝癌恶性程度的增加PTCH的mRNA表达量呈递减趋势，提示PTCH可能参与了肝细胞的早期癌变过程。     

没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌细胞凋亡

目的 探讨没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌细胞株凋亡的作用和机制.方法 以不同浓度EGCG处理人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞24 h和48 h.四甲基偶氮唑蓝比色法和锥虫蓝染色细胞计数评价细胞生长情况;流式细胞术检测细胞凋亡和环氧合酶-2(COX-2)、Bcl-2蛋白;比色法测定天冬氨酸蛋白酶-9和caspase-3活性;RT-PCR检测COX-2和Bcl-2家族mRNA的表达.结果 EGCG(50、100、200、400μg/ml)处理48 h后,HepG2细胞活性下降至93.8%±2.8%,62.3%±5.4%,33.9%±2.5%和17.6%±3.2%,与对照组(100.0%±2.8%)比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);SMMC-7721细胞活性下降至49.6%±3.5%,30.3%±3.8%,17.7%±2.2%和13.0%±2.5%,与对照组(100.0%±0.8%)比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);100 μg/ml EGCG处理细胞24、48、72和96 h后,HepG2活细胞计数(×104)分别是8.0±1.5,22.0±3.1,37.0±5.4和61.0±8.7,与对照组(15.0±2.5,45.0±5.3,86.0±11.0和210.0±23.0)相比明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.05);SMMC-7721活细胞计数(×104)分别是7.0±2.2,13.0±2.5,20.0±3.7和31.0±4.0,与对照组(14.0±2.2,40.0±4.3,75.0±8.8和182.0±28.0)相比明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.05).EGGG(50、100、200μg/ml)处理细胞12 h后,HepG2细胞凋亡率分别是8.7%±0.4%,18.1%±1.1%和22.1%±1.8%;SMMC-7721细胞凋亡率分别是5.9%±0.3%,7.8%±0.6%和12.2%±0.8%,与对照组(3.3%±0.3%)和(3.7%±0.4%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);EGCG(100、200μg/ml)处理细胞12 h后,HepG2细胞caspase-9活性为1.8±0.4和2.5±0.4;caspase-3活性为2.0±0.4和2.8±0.5,两者与对照组(1.0±0.1和1.0±0.2)比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);SMMC-7721细胞caspase-9活性为1.7±0.4和2.5±0.4,caspase-3活性为1.9±0.4和2.6±0.3,均显著高于对照组(1.0±0.1和1.0±0.2,P＜0.05).EGCG(200μg/ml)下调COX-2和Bcl-2的表达,而对Bcl-2家族其他成员表达无明显影响.结论 EGCG可能通过下调COX-2和Bcl-2的表达,激活caspase-9和caspase-3诱导肝癌细胞凋亡.     

输注受者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫功能的影响

目的 观察肝移植同时输注受者骨髓间充质干细胞(MSCs)对受者肝移植免疫功能的影响.方法 实验分为4组:A组SD大鼠只行剖腹探查;B、C、D组各组行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取受者MSCs同期经门静脉输注给受者,D组给予肌注CsA,B组给予门静脉输注生理盐水.观察术后第1、7、14天肝功能的变化、病理改变和细胞因子变化.结果 肝移植同时输注受者MSCs,谷氨酸转移酶、血清总胆红素较对照组显著降低,病理改变仅呈急性轻度排除反应,与肌注CsA组相似,而单纯移植组呈急性重度排除反应.术后第7天,白细胞介素(IL)-2和干扰素(IFN)-γ浓度,C组分别为(443.89±2.39)、(347.55±3.35)ng/L,B组分别为(600.36±2.98)、(373.77±1.81)ng/L,而IL-4和IL-10浓度,C组分别为(126.99±1.18)、(147.40±1.07)ng/L,B组分别为(102.02±0.94)、(111.03±1.15)ng/L,C组和B组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝移植同时输注MSCs,可通过抑制Th1细胞因子的表达,减轻受者对移植肝的排斥反应.     

受体骨髓间质干细胞在大鼠原位肝移植中对免疫排斥的影响

目的:观察受体骨髓间质干细胞(BM-MSCs)在大鼠原位肝移植后体内的分布与作用.方法:以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体采用双袖套法制作原位肝移植模型,密度梯度离心法分离与贴壁法富集受体BM-MSCs.CFSE标记术后经门静脉注入,荧光显微镜分别观测术后1wk,2 wk,1mo肝脾肺肾组织中BM- MSCs的分布及各时间点检测肝功能及肝组织免疫排斥情况.结果:密度梯度离心所得到的BM-MSCs为比较一致的球形单个核细胞,台盼蓝染色细胞活力达98%左右,其他细胞少见.BM-MSCs体外分离培养扩增至第3代后较为纯化.应用CFSE可快速高效的标记贴壁BM-MSCs.移植的BM-MSCs主要在受体肝脏中聚集,1mo后略有减少,而脾肺肾组织内BM-MSCs在1mo后仅有极少分布.B组无BM-MSCs输入与C组有BM-MSCs输入肝功能比较,C组肝功能有明显好转,B,C组间差异有显著意义(F=63.179,P<0.01),B,C组各时段肝功能差异有显著性意义(F=221.026,P<0.01).C组肝组织免疫排斥反应明显减轻.结论:原位肝移植术后输注受体BM-MSCs可有效缓解免疫排斥反应.