单性日本血吸虫成虫感染性小鼠肝纤维化研究北大核心CSCD

目的观察和评估单性日本血吸虫成虫感染小鼠出现肝纤维化病变风险。方法将40只小鼠随机分为双性感染组、单性雄虫组、单性雌虫组和未感染组,每组10只,分别经腹壁皮肤接触感染雌雄尾蚴、雄性尾蚴、雌性尾蚴和不含尾蚴的去氯水,感染尾蚴数为(40±1)条/只。双性感染组小鼠感染周期为6周,其余3组为36周。取小鼠肝脏,观察肝脏大体形态;经HE和Masson染色镜下观察小鼠肝脏病理变化和胶原纤维增生情况;测定肝脏胶原纤维特有的羟脯氨酸含量;应用荧光定量PCR和Western blot检测肝组织α-SMA、TGF-β1、Col1、Col3 mRNA和蛋白表达水平。结果与无感染组比较,单性雄虫组小鼠肝脏颜色发黑,肝组织内有大量色素沉积,周围有炎性细胞浸润,色素沉积处有胶原纤维;单性雌虫组小鼠肝脏大体形态与无感染组相似,病理变化和胶原纤维增生明显轻于单性雄虫组。单性雄虫组、单性雌虫组、双性感染组和未感染组小鼠的肝脏羟脯氨酸含量分别为(0.209±0.033)、(0.187±0.034)、(0.194±0.04)和(0.122±0.016)μg/mg,单性雄虫组、单性雌虫组均显著高于未感染组(P均<0.05),与双性感染组均无明显差异。单性雄虫组小鼠肝脏Col1(2.4±0.91)和α-SMA(0.22±0.1)mRNA表达都明显高于未感染组[Col1(1.05±0.29)、α-SMA(0.08±0.01)](P均<0.05),Col1(2.4±0.91)(P<0.01)和TGF-β1(4.28±2.58)(P<0.05)mRNA表达均显著高于双性感染组;单性雌虫组各基因mRNA表达水平与未感染组相比均无显著差异,Col1(1.34±0.18)和TGF-β1(3.55±1.34)mRNA表达水平也显著高于双性感染组[Col1(0.84±0.14)、TGF-β1(0.31±0.11)、α-SMA(0.36±0.11)、Col3(2.15±0.61)](P均<0.01),α-SMA(0.17±0.11)(P<0.05)和Col3(0.51±0.23)(P<0.01)mRNA表达则显著降低。单性雄虫组小鼠肝脏各基因蛋白表达水平与未感染组比较均无明显差异;单性雌虫组TGF-β1(1.03±0.39)蛋白表达量显著低于未感染组TGF-β1(1.78±0.29)(P<0.05)。结论单性血吸虫成虫会导致小鼠肝脏炎症细胞浸润,胶原纤维增生,羟脯氨酸增加、部分肝纤维化分子指标mRNA表达上调等肝纤维化特征和向肝纤维化演变趋势,并且单性雄虫比单性雌虫更易引发小鼠肝脏病变。     

日本血吸虫SjC21.7核酸疫苗诱导小鼠保护性免疫作用的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 1.7k Da膜蛋白分子 (Sj C2 1.7)核酸疫苗对 BAL B/ c小鼠的免疫保护性作用。　方法　采用 PCR方法扩增出特异性 Sj C2 1.7基因的开放阅读框序列 ,在其起始密码子处引入 Kozark序列。将目的基因片段亚克隆到真核表达质粒 pc DNA3.1中 ,构建重组真核表达质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1。 4 8只 BAL B/ c小鼠分为对照组、实验组和加强组。对照组小鼠的股四头肌注射接种 pc DNA3.1,实验组同法注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc D-NA3.1,加强组除注射重组质粒 Sj C2 1.7- pc DNA3.1外 ,同时注射重组质粒 P35 - pc DNA3.1及 P4 0 - pc DNA。每隔 2 wk免疫 1次 ,共免疫 3次。第 3次免疫后第 30天 ,每只鼠感染 4 5± 1条尾蚴 ,4 5 d后剖杀计数各组小鼠成虫数及肝卵数。通过 EL ISA和免疫组化分析观察小鼠免疫学特征的变化。　结果　免疫组化分析显示 ,实验组小鼠股四头肌局部组织有特异性抗原蛋白表达。EL ISA分析表明 ,免疫后实验组和加强组有部分小鼠出现特异性 Ig G抗体。与对照组比较 ,实验组减虫率及减卵率分别为 2 9.9%及 13.8% ,加强组分别为 31.9%及 2 8.0 %。加强组减卵率显著高于实验组(P<0 .0 5 )。　结论　 Sj C2 1.7核酸疫苗能诱导 BAL B/ c小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染     

血吸虫对吡喹酮抗药性的研究Ⅱ曼氏血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株虫卵和毛蚴对吡喹酮的反应性

目的　比较曼氏血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株虫卵和毛蚴对吡喹酮的反应性 ,旨在运用敏感株与抗性株反应性间的差异 ,建立简单快速吡喹酮敏感性检测方法。方法　将各株虫卵分别孵育于 5× 10 -6、10 -6、5× 10 -7mol/ L和 10 -7mol/ L吡喹酮溶液中 2 4h,后移至清水孵化 ,比较虫卵的孵化率。将各株毛蚴分别暴露于 10 -3 、10 -4 、10 -5、5× 10 -6、10 -6、5× 10 -7mol/ L和 10 -7mol/ L吡喹酮溶液中 ,0、1、5 min后观察比较毛蚴的运动及形态学变化。结果　经 10 -6mol/ L 和 5× 10 -7mol/L吡喹酮孵育 2 4h后 ,敏感株血吸虫虫卵的孵化率分别为 4.2 %和 3 0 .7% ,抗性株分别为 2 4.2 %和61.2 %。当毛蚴暴露于 5× 10 -6mol/ L吡喹酮中 ,敏感株 10 0 %毛蚴体中部立刻收缩变形 ,而抗性株仅见 13 .4%毛蚴变形 ;当暴露于 10 -6mol/ L 吡喹酮 0、1、5 min后 ,敏感株毛蚴的变形率分别为3 5 .5 %、63 .9%、91.2 % ;抗性株分别为 0、7.6%、14 .3 %。结论　曼氏血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株虫卵与毛蚴阶段对吡喹酮的体外反应性的差异均非常显著。提示 ,将毛蚴移入 10 -6mol/ L吡喹酮溶液中 1min,镜下观察其变形率 ,作为曼氏血吸虫对吡喹酮敏感性的检测方法 ,可用于现场判断病人化疗失败的原因是否是由于吡喹酮抗性     

日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析

目的寻找具有血吸虫病早期诊断价值的组分抗原.方法以感染后不同时间的兔血清,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Western blotting）方法,对日本血吸虫尾蚴、成虫和虫卵中的可溶性抗原的成分进行免疫分析.结果可溶性尾蚴抗原（SCA）94、48、41、40 kDa和38 kDa组分抗原最早出现免疫印迹反应,能被感染后2周兔血清所识别,可被感染后3周兔血清识别的SCA 71、23 kDa组分抗原反应最强.可溶性成虫抗原（AWA）最早出现反应的组分抗原是71、58 kDa,能被感染后3周兔血清所识别.可溶性虫卵抗原（SEA）最早出现反应的组分抗原是270、151、73、69、50 kDa和24 kDa,能被感染后4周兔血清所识别.结论 SCA 94、71、48、41、40、38、23 kDa,AWA 71、58 kDa和SEA 270、151、73、69、50、24 kDa能被急性感染兔血清所识别,是具有潜在早期诊断价值的组分抗原.     

小柴胡汤对体外培养LX-2细胞增殖的影响及机制初探

目的观察小柴胡汤对人肝星状细胞(LX-2细胞)增殖的影响。方法体外培养LX-2细胞,用不同浓度的小柴胡汤(2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%)处理24 h,对照组不做处理。显微镜下观察药物作用后细胞形态改变,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Edu)法检测细胞增殖,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测I型胶原(COL-Ⅰ)mRNA的表达情况。结果对照组细胞,贴壁生长良好,形态未见明显异常。经不同浓度小柴胡汤(2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%)处理24 h后,LX-2细胞均出现皱缩,变圆,界限不清,细胞核固缩等不同程度形态改变,MTT检测显示其增殖抑制率分别为100%、54.9%、41.2%、14.8%、12.4%。经1%、0.5%、0.1%小柴胡汤作用24 h后,Edu法检测LX-2细胞增殖率分别为0.1%、5.3%、10.1%;RT-PCR检测其COL-ⅠmRNA的表达量,与对照组1.04±0.35相比,均显著下降,分别为0.45±0.15(P<0.05)、0.27±0.16(P<0.01)和0.38±0.24(P<0.01)。MTT和Edu结果表明小柴胡汤能够抑制体外培养LX-2细胞的增殖,并呈剂量依赖效应。结论小柴胡汤通过抑制LX-2细胞增殖,并抑制COL-ⅠmRNA的表达,从而发挥抗纤维化活性。     

日本血吸虫SjC23蛋白质疫苗对核酸疫苗免疫增强作用的研究

目的　研究 Sj C2 3蛋白质疫苗对 Sj C2 3DNA疫苗增强小鼠的免疫保护作用的效果。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和 Sj C2 3大亲水片段融合蛋白质 (GST-HD)疫苗。把 48只 BAL B/ c小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (DNA和蛋白质疫苗联合免疫组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白质疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射 5 0 μgGST- HD+5 0 μg CFA1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0 μg pc DNA3.1。各组在末次免疫后 4周每鼠以 45± 2条日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 42 .9%的减虫率和 6 0 .0 %的减卵率 ,均显著高于单独Sj C2 3DNA疫苗组 2 8.1%的减虫率和 37.9%的减卵率 ,及单独蛋白质疫苗组 (GST- HD) 2 3.8%减虫率和 39.5 %的减卵率 (P均 <0 .0 5 )。联合组抗体水平     

日本血吸虫23 kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的　研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %     

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA：pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗，重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB／c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组，每组14只。A组为自然感染组；B组（空质粒对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1；C组（空质粒＋混合蛋白对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μl福氏完全佐剂（FCA）；D组（混合DNA组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗；E组（混合DNA＋混合蛋白组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周，蛋白加强组末次免疫后2周，所有小鼠同时经腹部皮肤感染（40±1）条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠，计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血，分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a，并取小鼠脾脏制备单个脾细胞，检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17．70％、32．88％和45．35％，D组和E组的减虫率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率显著高于D组（P〈0．01）；C、D组和E组的减卵率分别为9．39％、36．20％和48．54％，D组和E组的减卵率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率也显著高于D组（P〈0．05）。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，?     

大鼠肺孢子虫肺炎肺脏病理学变化的动态研究

目的研究大鼠肺孢子虫肺炎（PCP）不同病程的动态病理学变化。方法将雌性清洁级SD大鼠50只随机分成实验组和对照组，每组25只。实验组采用皮下注射地塞米松1mg／只／次、每周2次免疫抑制的方法诱导建立PCP的动物模型，对照组则注射相同剂量的灭菌生理盐水。在所有大鼠的饮水中加入1g／L盐酸四环素预防继发性细菌感染。免疫抑制3、5、7、9、11周后．每组各取5只大鼠进行解剖，分别制作肺组织印片，姬氏染色，检香肺孢子虫包囊，同时制作肺组织病理切片，HE染色，观察肺组织的病理学变化。结果用地塞米松诱导大鼠3周，其肺组织印片术查见肺孢子虫包囊，肺组织也未见明显的病理学改变；第5周，肺组织印片州均查见肺孢予虫包囊，肺组织出现病理学改变。并且病理学孜变随诱导时间的增加而加重；第7周主要表现为肺泡壁毛细血管轻度充血，间质内慢性炎性细胞浸润；至第9周至11周，则可见间质细胞增生、间质水肿、肺泡内出现粉红色泡沫样渗出物，部分肺组织呈现大片状实变区。对照组大鼠无异常表现，病原学检查阴性，肺脏组织无明显的病理学改变。结论应用皮下注射地塞米松免疫抑制诱导方法可成功建立肺孢子虫肺炎的大鼠实验模型，大鼠肺孢子虫肺炎的病理学改变以炎症、渗出、细胞浸润、间质细胞增生等为主．同时病理学改变随病程进展而加重。     

消喘膏贴敷对哮喘豚鼠Thl／Th2类细胞因子的影响

目的：观察消喘膏贴敷对哮喘琢鼠Thl／Th2类细胞因子的影响。方法：采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏加雾化吸入激发的方法复制豚鼠哮喘模型，外用贴敷给药，测定哮喘模型组和消喘膏组豚鼠用药前后引喘潜伏期的变化；光镜下检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸粒细胞(EOS)数量，用酶联免疫吸附法测定BALF上清中白细胞介素-4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)水平，并进行组间比较。结果：(1)贴敷后消喘膏组豚鼠引喘潜伏期延长，与哮喘模型组相比有显著差异(P＜0．01)；(2)消喘膏组豚鼠BALF中细胞总数和EOS计数与哮喘模型组相比减少(P＜0．01)，但与正常对照组相比仍增高(P＜0．01)；(3)消喘膏组豚鼠BALF上清中IL-4水平与哮喘模型组相比降低(P＜0．01)，但与正常对照组相比仍增高(P＜0．01)；IFN—γ水平略增高，但与哮喘模型组及正常对照组相比均无显著差异(P＞0．05)；(4)消喘膏组IL-4/INF-γ比值低于哮喘模型组(P＜0．01)，但仍高于正常对照组(P＜0．01)。结论：消喘膏贴敷后可将哮喘豚鼠模型中以IL-4升高为主的Th2优势逆转为以IFN-γ为主的Thl优势，进而减轻哮喘豚鼠的气道炎症。