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目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法。 方法 根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的分枝杆菌 16S rDNA 基因的保守区和突变区(第 129 ~ 267 位核苷酸的 A 突变区、第 430 ~ 500 位核苷酸的 B 突变区)分别设计引物和寡核苷酸探针,用地高辛标记引物并制备玻璃芯片。采用双重 PCR 技术分别对 16 种分枝杆菌标准株、5 种非分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株(非结核分枝杆菌 40 株、结核分枝杆菌复合群 80 株)进行扩增,扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测,尼龙膜显色,以显现蓝黑色斑点作为阳性信号,并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类。根据芯片杂交结果,选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行 DNA 测序。 结果 16 种分枝杆菌标准株和 120 株分枝杆菌临床分离株经 PCR 扩增均各产生 2 条 DNA 片段,其中 1 条长度为 272 ~ 280 bp,1 条长度为 183 ~ 192 bp。16 种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交,应用显色法芯片技术分析 16 种分枝杆菌标准株和 5 种非分枝杆菌标准株的特异性为 100%。120 株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针 a 杂交,其中 79 株确定为结核分枝杆菌复合群,38 株确定为非结核分枝杆菌(不产色分枝杆菌 17 株,胞内分枝杆菌 8 株,猿猴分支杆菌 6 株,瘰疬分枝杆菌 5 株,偶然分支杆菌 2 株),另 3 株只与分枝杆菌属探针 a 杂交,没有鉴定到种。选取的 26 株分枝杆菌临床分离株(结核分枝杆菌复合群 8 株,不产色分枝杆菌 5 株,胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各 3 株,瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各 2 株)DNA 测序显示,未鉴定到种的 3 株分枝杆菌中,1 株为结核分枝杆菌突变株,1 株为 Mycobacterium lentiflavum,1 株为 Mycobacterium arupense,芯片上无后 2 种菌株的特异性探针;其余 23 株菌株测序结果与芯片检测结果一致。 结论 显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,具有一定的临床推广应用价值。 相似文献
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目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10(CFP-10)/早期分泌抗原靶点6(ESAT-6)融合蛋白(CE融合蛋白)模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子,对随机噬菌体7肽库进行筛选,经3轮生物淘选后,随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法,选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列,其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr(WDAT)保守序列,该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测,有7个单噬菌体(1、5、6、10、13、14、18,S/N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示,单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白(分别为0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073 vs 0.118±0.026,均P〈0.05);单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率(95%,19/20)明显高于CE融合蛋白(60%,12/20),而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率(9/10)低于CE融合蛋白(10/10)。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位,并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位,提高了ELISA检测的敏感性,为进一步研究CE融合蛋白的? 相似文献
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结核分支杆菌耐药性快速测定方法及其评价 总被引:20,自引:1,他引:20
胡忠义 《中华结核和呼吸杂志》2003,26(2):107-109
近年来 ,结核分支杆菌 (MTB)耐药性问题日趋严重 ,已成为结核病控制的三大难题之一。由于传统的耐药性测定方法需时较长 ,远不能满足临床治疗的需要。因此 ,寻找快速、准确的耐药性测定方法已成为结核基础研究领域的一个重要课题 ,也是临床实践中亟待解决的问题[1,2 ] 。文中就耐药性快速测定的几种新方法研究进展综述如下。一、耐药性的表型检测方法1 快速培养仪检测系统 :该检测系统主要利用快速培养仪及Middlebrook 7H9液体培养基来快速测定MTB的耐药性。目前 ,所用的快速培养仪主要有BACTEC TB 96 0、Bac… 相似文献
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结核病金标法免疫学诊断临床应用研究 总被引:4,自引:0,他引:4
本介绍的金标法结核抗体诊断药盒.应用特异性膜抗原,点样于硝酸纤维膜,运用间接法原理检测结核抗体,具有特异性强、敏感性高等特点,全程操作仅2分钟,是目前世界上结核病诊断最快捷的方法。 相似文献
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目的 对耐多药MTB临床分离株进行利福布汀和利福平交叉耐药性研究分析,为利福布汀治疗耐多药MTB提供依据.方法 在96孔板上检测利福布汀和利福平对99株耐多药MTB菌株的90%最低抑菌浓度(MIC90),交叉耐药率数据分析采用x2检验,两组间MIC比较经对数转化后采用独立样本t检验.结果 利福布汀和利福平的交叉耐药率为85.9%(85/99).利福布汀的MIC90值为≤16 mg/L,中位数为2 mg/L;利福平的MIC9o值为≥2 mg/L,中位数>32 mg/L,利福布汀MIC90值仅为利福平的1/8 ~ 1/32.利福布汀和利福平交叉耐药率随利福平的耐药程度加大而上升,低耐利福平组和中耐利福平组的交叉耐药例数分别为0/9和5/9,而高耐利福平组几乎全部交叉耐药(98.8%,80/81).结论 利福布汀对利福平耐药MTB菌株有一定的抗菌活性,可作为利福类药物耐药结核病的可选择药物. 相似文献
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