威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持

文题释义： 牵张应力环境：即向各个方向拉伸的受力环境。通过FLEXCELL-5000拉力培养系统给予软骨细胞稳定、间歇性的平面拉伸运动,使细胞处在受力环境中生长,模拟拉力、剪切力等软骨细胞所受的生物力学刺激。 软骨细胞表型：正常软骨细胞以基质蛋白Ⅱ型胶原的分泌为标志,处在基质合成分解相对平衡的稳定状态,软骨细胞发生退行性病变时,其Ⅱ型胶原分泌降低,而基质金属蛋白酶等表达上调,代谢平衡打破,分解代谢上调。 背景：机械负荷是软骨细胞退行性改变及骨关节炎发展过程中的重要因素,威灵仙能够改善骨关节炎炎性微环境,但其对机械负荷诱导的软骨细胞退行性改变的作用尚未阐明。 目的：探讨威灵仙提取物对体外间歇性循环牵张拉伸诱导的软骨细胞退行性改变的影响及机制。 方法：Ⅱ型胶原酶消化法分离兔膝关节软骨细胞并通过阿利新蓝染色鉴定;实验将软骨细胞分为5组：空白组、间歇性循环牵张拉伸组、威灵仙低、中、高质量浓度组。空白组无任何干预,其他4组利用FLEXCELL-5000T牵张拉伸系统对软骨细胞施加间歇性循环牵张拉伸(10%拉伸强度、8 h/d、0.5 Hz、2 d)刺激,诱导软骨细胞退行性改变,威灵仙各组在施加相同的刺激同时添加0.5,1,2 g/L威灵仙提取物,干预48 h;CCK-8法检测各组软骨细胞增殖活性;FITC-鬼笔环肽染色观察各组细胞骨架形态;实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测各组细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、转化生长因子β的表达。 结果与结论：①与空白组相比,间歇性循环牵张拉伸刺激后软骨细胞骨架呈长条状拉伸状态,细胞增殖活性降低,转化生长因子β、Ⅱ型胶原表达均下调,而基质金属蛋白酶13表达上调;②与间歇性循环牵张拉伸组相比,威灵仙提取物能够促进软骨细胞增殖,上调转化生长因子β、Ⅱ型胶原表达,下调基质金属蛋白酶13表达,且效果与质量浓度相关;③结果表明,威灵仙提取物能够通过调控转化生长因子β表达抑制间歇性循环牵张拉伸诱导的软骨细胞分解代谢,促进软骨细胞外基质的合成,维持软骨细胞表型稳定。 ORCID: 0000-0003-0930-0467(涂鹏程) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

目的：探究温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞（MECs）吞噬髓鞘碎片的影响及其作用机制。方法：采用改良A11en’s法制备脊髓损伤小鼠模型,1、3、7d后通过HE染色和尼氏染色观察损伤脊髓的病理改变。利用ELISA法检测损伤脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平,通过3D激光共聚焦观察损伤脊髓中MECs吞噬髓鞘碎片情况,采用多重免疫荧光染色检测脊髓损伤后MECs中HDAC6、LC3B、NLRP3表达。结果：与模型组比较,温肾通督方明显减少脊髓损伤后炎症细胞的浸润和神经元的固缩坏死;显著降低脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平（P<0.01,P<0.05）;促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能下调HDAC6、NLRP3表达,上调LC3B表达（P<0.01）。结论：温肾通督方可能通过抑制HDAC6促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能同时阻断NLRP3通路的信号转导,共同改善炎性微环境,促进脊髓损伤修复。     

温肾通督方对脊髓损伤模型小鼠脾脏B细胞影响的蛋白组学研究

目的 探讨温肾通督方对脊髓损伤的影响及可能机制。方法 36只C57BL/6雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通督方组,每组12只。模型组、温肾通督方组小鼠采用改良Allen’s法建立小鼠脊髓损伤模型,假手术组仅进行脊髓暴露。温肾通督方组从术后第1天按50 g/（kg·d）给予温肾通督方溶液灌胃,假手术组及模型组给予生理盐水20 ml/（kg·d）灌胃,各组均连续灌胃14天。在术前及术后第1、7、14天,利用斜板试验及后肢运动功能（BMS）评分对小鼠运动功能进行评估;术后第3天通过肌电图及运动诱发电位检测小鼠神经电生理,测量各组小鼠脾脏长度,利用磁珠分选脾脏中的B细胞,通过蛋白组学技术分析蛋白差异表达情况,采用Western blot法检测脾脏B细胞中线粒体外膜转运孔蛋白20 (Tom20)及下游剪切化半胱氨酸蛋白酶3 (Cleaved Caspase-3)蛋白表达;术后第14天采用核磁共振观察小鼠脊髓恢复情况。结果与假手术组同时间比较,模型组在术后1、7、14天BMS主评分、副评分及斜板试验角度均降低,术后3天小鼠肌电图和运动诱发电位峰峰值降低、脾脏长度减少,脾脏B细胞中Tom20...     

关节软骨修复机制中相关信号分子的研究进展

关节软骨损伤后,在进行性退变过程中,分解代谢水平上调,软骨细胞会分泌多种炎症因子,原有的细胞表型也逐渐改变。因此长期以来,广大研究者针对促软骨细胞合成代谢、维持软骨细胞表型稳定做了大量的研究,并发现在一系列软骨修复过程中有多种分子信号通路参与。本篇综述重点介绍关节软骨修复中关键的信号分子,如:转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)等,并揭示和探讨这些分子在软骨损伤及修复过程中的作用,以便相关领域研究者广泛深入地了解软骨损伤修复过程中的分子机制,并在此基础上寻找软骨修复治疗靶点和更优的生物学治疗方法。     

姜黄素通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖的研究

【目的】探讨姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路对软骨细胞增殖的影响。【方法】取4周龄雌雄新西兰大白兔各1只,采用酶消化法构建体外软骨细胞培养体系;应用形态学观察、甲苯胺蓝染色方法进行细胞形态学鉴定;采用细胞计数试剂盒法(CCK-8法)检测不同浓度姜黄素给药24 h后对软骨细胞增殖的影响;将终浓度为5μmol/L、10μmol/L的姜黄素分别作用于软骨细胞12 h、24 h后,采用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路中Wnt 2、GSK-3β、β-catenin蛋白表达情况。【结果】当姜黄素的浓度为10μmol/L时,姜黄素对软骨细胞的促增殖作用最为明显。姜黄素能够促进Wnt/β-catenin信号通路中Wnt 2及β-catenin蛋白表达量,且10μmol/L组较5μmol/L组、24 h组较12 h组的表达量更高,24 h两浓度组与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05),但12 h的两浓度组与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05),而GSK-3β结果则正好与上述2种蛋白表达结果相反。【结论】姜黄素对软骨细胞具有一定的保护作用,是中药姜黄发挥抗骨关节炎作用的有效成分之一。     

600株葡萄球菌的临床分布和耐药性分析

目的通过对临床分离的600株葡萄球菌进行临床分布和耐药性分析,为葡萄球菌感染研究提供依据。方法选取沈阳医学院附属中心医院2013年1月1日至2014年12月31日临床标本中分离的600株葡萄球菌进行回顾性调查分析。结果 600株葡萄球菌以分泌物中检出最多,其次为痰液和全血。科室分布以手外科最多,其次是RICU。菌种则以葡萄球菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为主。对常用抗生素耐药性普遍较高,耐药率较低的有万古霉素/利奈唑胺/替考拉宁,对其他抗生素耐药严重。结论葡萄球菌对抗菌药物已产高耐药性,医院应加强规范化操作,合理应用抗生素。     

温肾通络止痛方抑制巨噬细胞衰老改善BMSC成骨分化和老年性骨质疏松模型小鼠骨丢失的研究

目的 探讨温肾通络止痛方调控巨噬细胞衰老对老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis, SOP)的干预作用。方法 利用过氧化氢制备衰老巨噬细胞模型并随机分为对照组、模型组、含药血清低剂量组、含药血清高剂量组。β-半乳糖苷酶染色以及qPCR、Western blot检测衰老指标p21和p53的mRNA及蛋白表达水平,探讨含药血清对巨噬细胞衰老的影响。使用活性氧(Reactive oxygen species, ROS)染色和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测巨噬细胞线粒体功能。qPCR检测巨噬细胞极化相关分子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、CD206、一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)的mRNA水平,免疫荧光检测巨噬细胞极化相关分子精氨酸酶(Arginase, ARG1)和iNOS的蛋白表达,评估含药血清对巨噬细胞极化的影响。qPCR检测成骨相关指标骨钙蛋白(Osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen ty...     

温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠MAPK信号通路的影响

目的：观察温肾通络止痛方对炎性骨丢失小鼠骨微结构和骨吸收的影响,探讨其抗炎性骨丢失的作用机制。方法：将50只小鼠随机分为正常组,模型组,阿仑膦酸钠组,温肾通络止痛方低、高剂量组,每组10只。腹腔注射脂多糖（5 mg/kg,1次/周）构建小鼠炎性骨丢失模型。采用HE和Micro CT方法观察股骨结构,ELISA法检测血清中IL-6、IL-1β、ALP、TRAP的表达量,RT-PCR法检测胫骨组织中NFATC1、CTSK mRNA的表达,Western blot法检测胫骨组织中JNK、ERK、p38、NFATC1、CTSK蛋白表达。结果：与模型组比较,温肾通络止痛方高、低剂量组均可改善骨小梁密度,减小骨髓腔间隙,缓解小鼠骨质流失;增加3D BMD、BV/TV、Tb.Th,降低Tb.Sp;降低血清中IL-1β、IL-6、ALP、TRAP的表达（P<0.01）;降低NFATC1、CTSK mRNA的表达水平（P<0.05）,并抑制NFATC1、CTSK、p38、ERK、JNK蛋白表达（P<0.01）。结论：温肾通络止痛方能够显著改善炎性介导的小鼠骨质流失,其作用机制可能与MA...     

蛇床子素对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其机制

目的探讨蛇床子素(OST)对小鼠单核细胞RAW264. 7细胞系向破骨细胞分化的影响及相关机制。方法通过使用RAW264. 7细胞系体外诱导培养破骨细胞;将RAW264. 7细胞系分为阴性组、对照组及OST组。以核因子κB受体活化因子配基(RANKL)诱导细胞分化,OST组以高、中、低浓度(100、10、1μmol/L)根据实验要求干预细胞系相应时间;采用CCK-8法筛选无细胞毒性的药物浓度组;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法测定阳性细胞数和融合指数;通过测定骨吸收板上溶解坑面积和培养液中的荧光强度评估OST对骨吸收功能的影响;使用荧光素酶报告基因法观察OST对RAW264. 7细胞系中活化T细胞核因子(NFAT)和核因子κB(NF-κB)表达的影响;应用q-PCR法检测OST对RAW264. 7细胞系中相关破骨基因活化T细胞核因子1(NFATc1)、组织蛋白酶K(CTSK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TRAP、干扰素β3(INTE-BETAβ3)、酪氨酸激酶(c-Src)表达的影响;应用Western Blot技术检测OST对RAW264. 7细胞系中NF-κB信号通路上相关蛋白膜p65、IκB、p-IκB、核p65表达的影响。结果通过CCK-8法筛选出1μmol/L和10μmol/L 2组药物浓度; OST组中的TRAP阳性细胞数和融合指数较对照组明显减少(P 0. 05),且中浓度组的抑制效果更明显(P 0. 05); OST组的骨吸收相对面积和荧光强度较对照组均受到明显抑制(P 0. 05),且中浓度组的抑制效果更明显(P 0. 05); OST可以明显抑制转录因子NFAT和NF-κB的启动(P 0. 05); OST可以抑制NFATc1等破骨相关基因的表达,除了Integrin-BETA3、c-Src外,2个浓度组组间比较差异均有统计学意义(P 0. 05);与对照组相比,OST可明显抑制细胞膜中p-IκB蛋白的表达(P 0. 05),促进IκB、p65的表达(P 0. 05),同时也抑制了细胞核中p65的蛋白表达(P 0. 05)。结论 OST可通过抑制NF-κB信号通路的表达而引起NFATc1等相关转录因子的下调来抑制破骨细胞的分化。     

大鼠骨髓单核细胞的快速分离方法及向破骨细胞的诱导分化

目的 建立一种简便高效的体外分离大鼠骨髓单核细胞的方法,观察其体外生长特性,并诱导其分化为破骨细胞。方法无菌条件下分离出SD大鼠的胫骨和股骨,使用环氧树脂管（EP 管）和移液枪头快速分离骨髓组织,再用红细胞裂解液去除红细胞。细胞培养过夜后收集悬浮细胞,加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）继续培养扩增后得到贴壁的骨髓单核细胞。观察骨髓单核细胞生长过程中的形态学特征;通过细胞计数试剂盒法（CCK-8）测绘细胞的生长曲线;用流式细胞仪检测细胞表面CD11b 的表达;在加入M-CSF 和核因子κB受体活化因子配基（RANKL）诱导分化后,用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和降钙素受体（CTR）免疫荧光染色鉴定其是否能分化为成熟破骨细胞。结果通过该方法获得的大鼠骨髓单核细胞培养1 d后基本呈小圆形,杂细胞较少。3 d后细胞数目稍多,两端开始出现触角,5 d后数目增多,细胞呈椭圆形,两端触角明显;细胞的增殖依赖于M-CSF;流式结果显示,通过此方法获得的单核细胞纯度较高;TRAP 染色和CTR 免疫荧光染色结果提示,通过该方法获得的单核细胞可以诱导为成熟破骨细胞。结论通过EP管和移液枪头装置可快速分离 获取单核细胞,获得的细胞表型稳定,适合用于骨代谢疾病的进一步研究。