人体静脉血样采集管的不同内表面状态对血小板活化的影响

目的 研究人体静脉血样采集管的不同内表面状态对血小板活化的影响.方法 用聚环氧烷-聚二甲基硅氧烷共聚物(L722)、硅烷偶联剂对塑料管(PET)和玻璃管制膜,对L722玻璃管、L722 PET管、玻璃管、PET管、硅烷偶联剂制膜玻璃管及聚丙烯管(PP)内表面进行接触角分析.用上述材料的血样采集管采集血液标本并在室温下滚动混匀孵育110～60 min.用流式细胞术(FCM)检测血小板激活标志物CD62p.结果 不同材质及表面处理血液采集管的内表面的接触角大小在一定程度上反映了血小板活化率,但并不呈线性关系.PET管经L722表面改性后表达CD62p阳性的活化血小板百分率由(37.4±14.8)%下降到(21.9±12.4)%.玻璃管对表达CD62p阳性的活化血小板百分率为(54.5±18.6)%,明显大于PET管.玻璃管制膜后对血小板的激活明显减少,用硅烷偶联剂制膜的玻璃管表达CD62p阳性的活化血小板百分率为(28.3±8.2)%,明显低于L722制膜玻璃管.用PET作为基体材料经过L722表面处理后对血小板活化明显低于L722制膜的玻璃管的(41.5 ±15.9)%和用硅烷偶联剂制膜的玻璃管的(22.0±12.8)%.不同管对血小板活化时间进程显示:60 min L722 PET管和聚丙烯管的血小板活化与30 min的结果差异无统计学意义.结论 不同材质及表面处理血液盛装管所导致的不同表面能状态对血小板活化的影响有明显差异,硅油表面处理能有效改善血液采集管的血液相容性.FCM检测CD62p是评价血液收集管材料介导的血小板活化的灵敏指标,对建立血液盛装材料表面处理模型及筛选临床应用材料具有重要意义.     

大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的 研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件，探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法 采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞，观察在化学限定培养条件下，肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果 肝细胞培养时间进程显示：10mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞^3H—TdR掺入作用，在60和84h出现2个DNA合成峰；2％DMSO抑制^3H-TdR掺入，但在NA共同作用下，肝细胞在132h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示：HPN NA DMSO培养72h时肝细胞为正常二级分裂，168h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论 NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖，所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究，并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

EDTA-丁胺卡那抗凝管稳定期的研究

目的研究观察EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管的稳定期。方法以新鲜配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管为测定管,批量制作的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管为对照管,在不同的时间段(一个月、三个月、六个月、一年)测定多名由于EDTA依赖而造成血小板假性减少症患者的血小板数,分析不同时间段EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管血小板计数情况,观察其稳定性。结果与新鲜配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管相比,第一个月:批量配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管,在4h内血小板数稳定;第三个月及半年:批量配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管、1h内血小板数稳定,随着时间的推移血小板计数呈下降趋势;一年:批量配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素抗凝管半小时内血小板计数稳定,其后随着时间的延长而下降。结论新鲜配制的EDTA-K2丁胺卡那霉素可以有效抑制和解离因血小板凝集而造成的血小板假性减低,4h内血小板计数稳定;而批量制作的EDTA-K2丁胺卡那霉素作血小板计数以4h为界限的话,其稳定性(有效期)只能维持一个月,介于这种情况,不适宜大批量生产,机理有待进一步探讨。     

二甲亚砜、尼克酰胺对肝细胞生长素促肝细胞增殖的影响

为探讨原代肝细胞体外增殖和分化的培养条件和机制，观察了肝细胞生长素（HPN）、二甲严砜（DMSO）有尼克酰胺（NA）对肝细胞增殖、分化的影响。结果显示肝细胞生长素刺激离体肝细胞H-TdR掺入和钙动员。DMSO抑制钙动员，NA无显著影响。肝细胞原代培养证实：NA促进DNA合成，而DMSO抑制^3H-TdR掺入，但DMSO在NA协同下使肝细胞表现为一定的延迟合成活性；肝细胞cAMP在水平96h内与增殖活性呈负相关。7d条件培养后，DMSO＋HPN及DMSO＋NA＋HPN培养组肝细胞对^3H-TdR掺入分别为NA＋HPN组的3．83及3．58倍，[Ca^ ]i瞬增分别为3．0及3．3倍。表明HPN具有体外刺激原代肝细胞增殖和分化的作用，加NA可以促进肝细胞DNA合成；DMSO则抑制^3H-TdR掺入，长期表现为稳定肝细胞作用，移除DMSO后肝细胞具有较高的增殖活性。     

一氧化氮诱导对肝细胞内环境稳定的影响

目的 研究肝细胞诱导性一氧化氮（NO）及外源性NO对肝细胞内环境稳定的影响。方法 用内毒素及细胞因子诱导培养大鼠肝细胞内源性NO及应用外源NO供体硝普钠（SNP）与原代肝细胞作用，观察肝细胞丙二醛（MDA），还原型从胱苷肽（GSH）及细胞内游离钙的变化规律。结果 内毒素 细胞因子作用肝细胞24h后，肝细胞MDA增高7.97倍及GSH降低57.9%，一氧化氮合酶（NOS）竞争性抑制剂，N^G-甲基-L-精氨酸使肝细胞MDA及GSH分别逆转43.5%和98.4%。异搏定显著抑制内源性NO合成及相关氧应激，A23187的作用不显著，而氯丙嗪和α-生育酚并不导致内毒素 细胞因子诱导肝细胞释放的NO下降，SNP作用肝细胞表现为可逆性增强氧化态，但外源NO显著抑制K^ 去极化及肝细胞生长素诱导动员的肝细胞游离钙瞬增，结论 在内毒素及细胞因子导致肝细胞代谢和功能应激反应中，诱导NO，独立介导脂质过氧化和抗氧化能力下降，可能具有起始关键作用；NO抑制肝细胞内游离钙动员，可能通过负反馈调节与蛋白激酶C相关的NOS诱导而作为一种重要的肝细胞内伺服调控机制。     

一氧化氮诱导对肝细胞内环境稳定的影响

目的研究肝细胞诱导性一氧化氮(NO)及外源性NO对肝细胞内环境稳定的影响。方法用内毒素及细胞因子诱导培养大鼠肝细胞内源性NO及应用外源NO供体硝普钠(SNP)与原代肝细胞作用,观察肝细胞丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)及细胞内游离钙的变化规律。结果内毒素+细胞因子作用肝细胞24h后,肝细胞MDA增高7.97倍及GSH降低57.9%,一氧化氮合酶(NOS)竞争性抑制剂NG-甲基-L-精氨酸使肝细胞MDA及GSH分别逆转43.5%和98.4%。异搏定显著抑制内源性NO合成及相关氧应激,A23187的作用不显著,而氯丙嗪和α-生育酚并不导致内毒素+细胞因子诱导肝细胞释放的NO下降。SNP作用肝细胞表现为可逆性增强氧化态,但外源NO显著抑制K+去极化及肝细胞生长素诱导动员的肝细胞游离钙瞬增。结论在内毒素及细胞因子导致肝细胞代谢和功能应激反应中,诱导NO、独立介导脂质过氧化和抗氧化能力下降,可能具有起始关键作用;NO抑制肝细胞内游离钙动员,可能通过负反馈调节与蛋白激酶C相关的NOS诱导而作为一种重要的肝细胞内伺服调控机制。     

大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件,探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞,观察在化学限定培养条件下,肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果肝细胞培养时间进程显示:10 mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞3H-TdR掺入作用,在60和84 h出现2个DNA合成峰;2% DMSO抑制3H-TdR掺入,但在NA共同作用下,肝细胞在132 h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示:HPN NA DMSO培养72 h时肝细胞为正常二级分裂,168 h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28 d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖,所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究,并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

肝细胞一氧化氮合酶的诱导及动力学研究

目的对内毒素和几种细胞因子诱导肝细胞一氧化氮合酶的协同效应及酶动力学参数进行研究.方法原位预灌流和段原酶循环灌流大鼠肝脏、分离肝实质细胞,观察内毒素、IFN-Y、IFN-α、TNFα、IL-lβ、IL-6及不同组合对肝细胞一氧化氮合酶活性、cGMP及NO2-+NO3的影响,分析酶动力学特征及皮质甾与酶诱导的量效关系.结果内毒素+IFN-v+TNFα+IL-lβ(IL-6)组合诱导酶表达效应最显著;酶参数分析显示Km、Vmax分别为108μmol/L和2632pmol@min1mg-1蛋白质,竞争性抑制剂L-NMMA、L-NNA作用的Ki分别为056μmolL及094μmol/L;诱导时间进程显示iNOS活性表达在9h达到峰值,但cGMP及NO2-NO3-的释放持续增加可维持至l8h;地塞米松和氢化可的松抑制肝细胞酶诱导的IC50分别为35×10-8mol/L和26×10-0mol/L.结论肝细胞诱导性一氧化氮合酶的表达依赖特异多细胞因子协同作用,这种可诱导性特征可能在内毒素血症和败血症休克发病机制中具有重要意义.