环孢子虫的研究进展

环孢子虫是一种新出现的致病性球虫,经食物或水源传播,可引起人和动物胃肠炎和持续性腹泻,引起全球关注。本文仅对其病原生物学、流行病学及诊断方法等方面的研究进展进行综述。     

感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化指标的变化

目的检测感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化体系指标。方法对安徽省某奶牛场325头奶牛粪样采用饱和蔗糖溶液漂浮法检测隐孢子虫感染情况。选择隐孢子虫感染强阳性的7头奶牛作为感染组,同时取7头隐孢子虫粪检阴性奶牛作为对照组,早晨饲喂前从奶牛颈静脉采血,分别测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)、中性粒细胞吞噬率、T淋巴细胞转化率、白细胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、甘油三脂(TG)、Cl-和Ca2+等19项指标。结果 325头奶牛隐孢子虫感染率为31.7%(103/325),根据卵囊的形态和大小,初步鉴定为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)。与对照组相比,感染组奶牛血清中TP、ALB、IgM、IgA、GSH-Px、ALT、AST、ALP和Cl-含量无显著变化(P>0.05);血清中MDA和NO含量分别升高59.9%和28.1%(P<0.05或0.01);而血清中IgG、SOD、GLU、TG、Ca2+和IL-2含量,以及T淋巴细胞转化率和中性粒细胞吞噬率分别降低了32.9%、11.1%、18.6%、78.9%、14.5%、7.0%、22.0%和20.2%(均P<0.05)。结论感染隐孢子虫奶牛部分免疫指标下降,抗氧化酶活性降低,清除体内自由基的能力减弱。     

MIC5基因在13株不同基因型的刚地弓形虫中的序列变异（英文）北大核心CSCD

目的检验13株来自不同宿主和地理位置,且归属于不同型的刚地弓形虫的MIC5基因的序列变异情况,评价MIC5能否作为研究种群遗传学的理想标记。方法对13株刚地弓形虫的MIC5基因进行了序列比对,并使用了最大简约法,最大似然法以及贝叶斯法对所检验的虫株进行了系统进化分析。结果所有的虫株其MIC5基因的长度都为1 975bp。序列比对显示有52个核酸变异位点(0-1.3%),其中有38变异位点个在3个内含子上,14个变异位点在4个外显子上。所检基因的A+T含量为:51.70%-51.95%。结论 MIC5基因的序列变异率较低,所以MIC5基因并不是一个研究种群遗传学的理想标记。     

相对定量检测HIV/AIDS病人PBMCs中TIGIT mRNA表达水平的方法建立

目的建立检测人外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)信使核糖核酸(mRNA)表达水平的相对定量方法,并探讨TIGIT在艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(简称HIV/AIDS病人)临床监测中的意义。方法设计基因TIGIT引物3对,并利用超声波-煮沸法提取人PBMCs总RNA,选用管家基因GAPDH作为内参,然后用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行反转录及扩增TIGIT基因。利用软件测定电泳条带的灰度值(IOD),计算TIGIT mRNA的相对表达量。结果超声波-煮沸法提取的RNA纯度(A260/A280=1.71±0.056)优于超声波法(A260/A280=1.51±0.023)和煮沸法(A260/A280=1.375±0.078);筛选出扩增条带清晰且单一的TIGIT引物;相对定量结果表明,TIGIT mRNA在HIV/AIDS病人中的相对表达量均数(0.520 4±0.067)显著低于健康人群(1.383±0.093),差异有统计学意义(t=7.206,P=0.0167)。结论所建立的相对定量RT-PCR检测方法具有成本低、简单易行的优点,可应用于检测HIV/AIDS病人外周血中TIGIT mRNA的表达差异。     

扬子鳄源粘质沙雷氏菌XCYZE株的分离鉴定及其致病性分析

目的 查明一例源于安徽省扬子鳄管理中心的幼鳄死因。方法 从幼鳄脑部组织坏死灶采集病料,进行细菌分离与鉴定,并对其致病性进行分析。结果 菌落在血琼脂平板上生长呈红色的革兰氏阴性菌;生理生化试验显示该菌在葡萄糖、甘露醇、乳糖、柠檬酸盐和硫化氢等中均呈阳性;PCR扩增其16S rDNA基因,其大小约1 500 bp,经遗传进化树分析,与已报道的粘质沙雷氏菌GRD1株在同一分支;其致病性试验可导致实验鼠在36 h内全部死亡,出现严重肺出血、肝脏肿大、脾脏肿大、腹水现象等。结论 从扬子鳄脑内分离的病原是粘质沙雷氏菌,具有较强的致病性,且对多种抗菌药具有一定的耐药性。本试验为野生动物或者人类感染粘质沙雷氏菌的诊断和治疗提供参考意见。     

弓形虫棒状体基部蛋白38(ROP38)通过Toll样受体4(TLR4)诱导小鼠树突状细胞成熟

目的体外分析Toll样受体4(TLR4)诱导感染弓形虫棒状体基部蛋白38(ROP38)对小鼠树突状细胞(DC)成熟的影响。方法以异硫氰酸胍方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,采用PCR扩增ROP38,将ROP38连接至原核表达载体构建重组质粒pG EX-4T-ROP38;利用ProtS cale在线软件分析ROP38蛋白的亲水性和疏水性,利用DNAStar8.0分析ROP38蛋白的抗原表位;将重组质粒pG EX-4T-ROP38转化E.coli Rosetta感受态细胞,挑取阳性单菌落用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达,Western blot法检测ROP38蛋白水平。利用0.28 mg重组ROP38蛋白刺激小鼠骨髓来源DC,同时采用TLR4抗体封闭和空白处理为对照组。采用流式细胞术分析CD11c表达水平,运用SPSS23.0软件进行单因素方差分析。结果成功扩增弓形虫ROP38基因,其大小为516 bp,测序结果显示所获基因与GenB ank中已报道的序列(XM_002366710.2)同源性高达99%;ROP38基因序列生物信息学分析表明,ROP38蛋白含有5个α螺旋,5个β折叠,5个亲水性区域和8个可预测的抗原表位;重组质粒pG EX-4T-ROP38经IPTG诱导后,表达蛋白质的相对分子质量(Mr)为45 000,主要以包涵体形式存在。ROP38抗原刺激小鼠源DC后,其CD11c+表达水平明显高于TLR4抗体封闭组和空白对照组。结论 TLR4可诱导ROP38刺激小鼠DC的成熟。     

HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受体-1的表达及临床意义

目的 探讨HIV感染及抗病毒治疗对程序性死亡受体-1(programmed death-1, PD-1)表达的影响。方法 根据是否接受抗病毒治疗将61例HIV/AIDS患者分为治疗组及未治疗组,并以35例健康者作为对照。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术探究基因PD-1 mRNA在人外周血单个核细胞(PBMC)中的表达;通过双夹心抗体ELISA法测定血清中可溶性PD-1(sPD-1)表达水平。并比较不同CD4⁺ T淋巴细胞数的HIV/AIDS患者血清sPD-1的差异。结果 未治疗组、治疗组、健康组研究对象PBMC中PD-1 mRNA的相对表达量均数分别为0.337 8±0.064、0.578 2±0.073和0.771 5±0.124,健康组与未治疗组差异极显著,健康组与治疗组、治疗组与未治疗组之间差异显著(P=0.031、P=0.043);未治疗组、治疗组、健康组血清sPD-1浓度分别为42.22±2.21 ng/mL、38.24±2.79 ng/mL和29.88±1.41 ng/mL。健康组与未治疗组、治疗组,治疗组与未治疗组分别具有显著性差异(P=0.008、P=0.040和P=0.020)。差异性分析结果表明,未治疗组、治疗组CD4⁺T淋巴细胞数<350 个/mm³患者血清sPD-1水平均显著高于CD4⁺T淋巴细胞数>350 个/mm³患者。结论 抗病毒治疗在一定程度上使高水平sPD-1表达下调以促使PD-1/PD-L1通路的恢复,从而促进机体免疫重建。监测PD-1 mRNA及sPD-1的表达在HIV的辅助诊断和推断病情发展上具有一定的价值。     

人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立

目的建立一种高度敏感和特异的人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法。方法根据人隐孢子虫与其他隐孢子虫粘附蛋白p23基因的多重比对,设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段;采用RT-PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针引物进行液相杂交,将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合,再与辣根过氧化酶标记的抗地高辛抗体反应。用所建立的方法对22份临床样本进行检测,并与常规检测方法进行比较。结果所建立的RT-PCR-ELISA检测方法具有高特异性和敏感性,比常规的PCR方法灵敏度提高了100(0.08:8ng)左右。临床检测结果显示,该方法的检出率高达86%(19/22),而RT-PCR、蔗糖漂浮法和抗酸染色法的检出率仅为27%(6/22)、27%(6/22)和50%(11/22)。结论本试验成功建立了人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法,检出率比常规检测方法高。     

贝氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的研制

目的研制禽类贝氏隐孢子虫的PCR检测试剂盒。方法根据贝氏隐孢子虫18SrRNA和ITS-1序列,选取遗传标记位点最多的一段核苷酸序列作为特异PCR引物的靶序列,设计、合成了一对针对贝氏隐孢子虫的特异性引物(YJWF:5’-ACTGATATACAATACCACGG-3’和YR:5’-GCGGATAAAGTTCAGGTTC-3’),对PCR反应条件进行了一系列优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、稳定性、重复性和保存期等进行了系列研究。结果该试剂盒能特异性地扩增出贝氏隐孢子虫基因组中相应片段,与安氏隐孢子虫,微小隐孢子虫,柔嫩艾美尔球虫等相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到3.48个卵囊;反复冻融50次对试剂盒没有影响;室温条件下至少可保存4个月。结论该试剂盒的各项指标达到了贝氏隐孢子虫的检测要求。     

猴源人隐孢子虫P23抗原基因克隆表达及其免疫活性的测定

为探索隐孢子虫病免疫预防的新途径,本文对猴源人隐孢子虫Cryptosporidium hominis P23抗原基因进行了克隆、表达及其免疫活性的测定.采用RT-PCR方法对猴源C.hominis P23抗原基因进行克隆,构建重组质粒pGEX 4T 1 P23,并用IPTG诱导其在E.Coli Rossetta中表达;...