口蹄疫病毒实时RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立了一种实时RT-PCR的方法，用于检测口蹄疫病毒，并优选出最佳检测样品。方法设计合成一套引物和TaqMan探针，通过反应条件的优化，建立实时RT-PCR的方法，以扩增口蹄疫病毒的3D基因，并用该法检测患病仔猪的气管、前肢肌肉、皮肤、舌、颈浅淋巴结、脾脏、喉头、食管、腹股沟淋巴结、肺脏、扁桃体、肝脏、肾脏、胸肌、心脏、鼻黏膜、后肢肌肉、脑、骨髓、软腭和血清等样品。结果（1）该方法检测FMDV下限为0．01TCID50其敏感性比普通RT-PCR高100倍，并具有较好的特异性和重复性，（2）FMDV感染仔猪血清、淋巴结、扁桃体和肝脏中病毒含量较高是检测口蹄疫病毒很好的样品。结论建立了一种实时RT-PCR检测口蹄疫病毒的方法。     

我国首次分离出一株具有三相鞭毛抗原的沙门氏菌

具有三相鞭毛抗原的沙门氏菌,国内外尚未见报道,近来我们分离出一株,现报告如下。材料和方法一、菌株来源:南京动植物检疫所送检菌株(该所从蝮蛇肠道内分离所得)。     

布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立

目的为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建。方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E. coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集。结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌。结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景。     

2006-2008年江苏地区不同宿主感染空肠弯曲菌及其耐药性

目的检测2006-2008年江苏地区鸡、水禽、奶牛、丹顶鹤、猪、实验猴等标本感染空肠弯曲菌及其耐药性。方法采用APICampy System进行生化与分类鉴定,结合弯曲菌多重PCR检测方法对来自江苏地区的禽、牛、猪、猴3 010份标本,检测分离株及其耐药性。结果共检测样本3010份,402份空肠弯曲菌阳性,阳性率13.36%,其中家禽样阳性率15.83%（258/1630）;水禽10.40%（52/500）;奶牛7.65%（39/510）;猪18.75%（30/160）;猴15.00%（15/100）;丹顶鹤12.50%（10/80）;糜鹿0%（0/30）。选择不同宿主来源的108株对10大类27种抗生素高度敏感率的是：氯霉素100%、阿莫西林99.07%、阿米卡星92.59%、头孢噻肟91.67%、阿齐霉素90.74%;高度耐药率的是：头孢哌酮99.07%、复方新诺明99.07%、头孢孟多99.07%、磺胺甲基异噁唑97.22%、头孢拉丁91.67%。结果显示,108株分离株的耐药主要集中在9耐～20耐,占85.19%,猪分离株的多重耐药性较其它宿主来源分离株严重。结论江苏地区空肠弯曲菌的流行和耐药状况呈现多样化和复杂化,不同宿主来源分离株耐药性和多重耐药性存在差异。     

空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原的设计、表达与鉴定

构建空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,免疫动物后检测其抗血清与空肠弯曲菌菌体的反应性。从空肠弯曲菌的6个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段,将其插入原核表达载体,获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,经IPTG诱导后表达出25k的目标蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,Western blot和间接ELISA检测重组蛋白抗原性和抗血清反应性。结果表明目标蛋白具有良好的反应原和免疫原性,抗血清能与菌体发生反应。其抗体可用于C.jejuni免疫磁珠和免疫胶体金等检测方法的建立。     

间接ELISA法对H pylori免疫牛初乳中抗体的检测

目的:建立间接ELISA法测定牛初乳中H pylori抗体的水平,并观察特异性抗体的产生规律．方法:本试验以H pylori全菌抗原免疫妊娠母牛,每头牛每次肌肉注射4×109CFU全菌抗原, 收集分娩后7 d内的初乳．以间接ELISA法检测其中H pylori抗体水平．结果:H pylori能有效地引起免疫应答,成年牛初乳中的抗体效价在分娩当天达到最大值 5．84,高于青年牛的3．51(P<0．05),随后迅速下降．对照奶牛仅在分娩当天检测到微弱阳性．结论:成年牛的对H pylori的免疫应答好于青年牛．     

空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备

目的为获得空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体,用于空肠弯曲菌的检测和研究。方法用空肠弯曲菌ATCC29428株灭活全菌作为抗原,免疫BALB/c小鼠,待抗体水平达到1∶51 200时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0进行融合。同时以粗提天然鞭毛蛋白和人工表达重组鞭毛蛋白包板,用间接ELISA方法筛选,多次克隆化培养后获得的单抗用Western blot进行生物学特性鉴定。结果获得3株持续、稳定分泌抗空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G8、1G9和3F2。结论获得的空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体为建立空肠弯曲菌的蛋白检测及后续研究奠定基础。     

西尼罗病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立荧光RT-PCR方法,用于检测西尼罗病毒(WNV)。方法从GenBank上调取WNV的基因序列,设计WNYA、WNYB、WNYC三套荧光RT-PCR,经优化后用于WNV灭活苗、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)等11种病毒核酸的检测,同时用10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增,以检测其灵敏度。结果建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR检出WNV灭活苗阳性,而JEV等10种非WNV病毒均为阴性,能检出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA、420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA;WNYB的反转录效率明显低于WNYA和WNYC。结论建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR可作为检测WNV的技术储备。     

南京口岸入境船舶食品和垃圾中的细菌污染情况调查

目的 了解入境船舶食品和垃圾中携带致病细菌的情况，为制定检疫处理对策提供依据。方法 对南京口岸部分入境船舶上的动物产品、生活垃圾按照国标法(GB4789-94)和3M纸片法等快速方法检测细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌等项目。结果 动物肉类产品菌落总数在10^2cfu／g-105cfu／g之间；大肠菌群MPN值在0～1000／100ml(g)之间；垃圾、泔水菌落总数都在10^8cfu／ml(g)以上，大肠菌群MPN值在1000／100Hll(g)以上；同时检出多种条件致病菌。结论 加强入境船舶携带食品和垃圾的卫生检疫和卫生除害处理。