低氧无血清对乳鼠心肌细胞皮肤桥蛋白表达的影响

 目的 在体外用低氧无血清条件模拟缺血心肌微环境,探讨心肌细胞皮肤桥蛋白(DPT)表达的变化。方法 以低氧无血清处理乳鼠心肌细胞0 、6 、12 和24 h,用实时反转录聚合酶链式反应检测DPT mRNA的表达变化,用Western blot检测DPT的蛋白表达变化。用酶联免疫吸附实验（ELISA）证实低氧无血清处理乳鼠心肌细胞24 h DPT蛋白的表达变化。结果 与0 h组相比,低氧无血清处理心肌细胞6 、12 、24 h DPT的mRNA和蛋白水平均显著升高（p<0.05）。ELISA的方法也检测到低氧无血清处理心肌细胞24 h DPT的表达水平高于正常对照组（p<0.05）。结论 低氧无血清可促进乳鼠心肌细胞DPT的表达,DPT可能在缺血缺氧引起的心室重构中发挥一定的作用。     

信号转导及转录激活因子3对心肌细胞基质金属蛋白酶-10活性的影响

目的:探讨信号转导及转录激活因子3(STAT3)对心肌细胞基质金属蛋白酶-10(MMP-10)活性的影响.方法:以炎症细胞因子C反应蛋白(CRP)诱导基质金属蛋白酶-10上调的原代乳鼠心肌细胞为研究对象.使用STAT3的特异磷酸化抗体,用蛋白免疫印迹杂交技术检查STAT3的磷酸化水平.提取细胞核蛋白,应用滤板法检测核内转录因子STAT3的脱氧核糖核酸(DNA)结合活性,并转染STAT3小分子干扰核糖核酸(siRNA),进一步分析转录因子STAT3对基质金属蛋白酶-10的调节作用.结果:磷酸化的STAT3在C反应蛋白刺激后5 min即可出现高表达,一直持续至2 h,而总的STAT3不随C反应蛋白作用的时间而改变.C反应蛋白作用不同时间,核内STAT3的DNA结合活性均可明显增加,且在12 h达到高峰 (P<0.01).加入STAT3 siRNA后,基质金属蛋白酶-10的活性明显减弱(P<0.01),STAT3的蛋白表达以及核内STAT3的DNA结合活性(P<0.01)也均降低.结论:STAT3作为转录因子能够促进C反应蛋白诱导基质金属蛋白酶-10活性的增加.     

接触抑制对转化生长因子β诱导基因22（TSC-22）在心脏成纤维细胞中表达的影响

目的通过建立体外原代培养的新生大鼠心脏成纤维细胞模型,研究接触抑制对TSC-22表达的影响,并为进一步探明TSC-22在心脏成纤维细胞中的确切功能奠定基础。方法采用差速贴壁法原代分离培养Sprague-Dawley大鼠心脏成纤维细胞,分别进行下述实验:①以不同初始密度接种细胞,分为两组:A组为50%融合组:以1.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;B组为100%融合组:以2.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;②均以2.0×105/ml的初始密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,分为4组:A组为未融合组:接种后培养6h(至贴壁未融合状态);B组为融合组:接种后培养24h(至100%融合状态);C组为胰酶消化打破融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养6h(此时细胞重新贴壁但未融合);D组为胰酶消化重新达融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养24h(此时细胞重新达到100%融合)。以上各组分别提取mRNA和蛋白,应用实时定量PCR(real-time PCR)、蛋白印记(Western blotting)法分别检测TSC-22 mRNA、蛋白表达的变化。结果实时定量RT-PCR和蛋白印记结果表明:①心脏成纤维细胞融合度达到100%,即发生接触抑制时,与50%融合度组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平水平均显著升高(P<0.05);②融合组心脏成纤维细胞与未融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高;胰酶消化打破融合组心脏成纤维细胞与融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著下降;胰酶消化重新达融合组成纤维细胞与胰酶消化打破融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高(P均<0.05)。结论本实验结果明确表明,在体外培养的心脏成纤维细胞中,接触抑制是诱导TSC-22表达升高的重要因素。当心脏成纤维细胞发生接触抑制时,TSC-22可能通过行使其转录因子的生物学功能,在接触抑制后所触发的信号通路中发挥重要调控作用。对TSC-22确切功能的深入研究,将有助于进一步理解和阐明心脏重构机制。     

神经母细胞瘤形成抑制因子DAN对PDGF-BB诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用及其机制初探

目的初步探讨神经母细胞瘤形成抑制因子DAN对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖的影响及其相关信号通路。方法培养人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs),以10ng/mlPDGF-BB诱导HPASMCs增殖,在PDGF-BB刺激前1h预先加入DAN,用MTS法检测HPASMCs增殖的变化情况,用western blot法观察cyclinD1的表达变化和p38MAPK的磷酸化水平的变化情况。结果不同浓度(0.25,0.5,1μM)DAN作用24h,可呈浓度依赖性降低PDGF-BB诱导的HPASMCs的增殖率。DAN作用24h,可降低PDGF-BB刺激引起的CyclinD1的表达(p<0.05),PDGF-BB刺激HPASMCs5min时,p38MAPK的磷酸化水平升高最为明显(p<0.01),DAN可明显降低PDGF-BB刺激的p38MAPK的磷酸化水平(p<0.01)。结论初步证明DAN可抑制PDGF-BB诱导的HPASMCs的增殖,其机制可能是通过p38MAPK-CyclinD1信号通路进行调控。     

MMP-7、MMP-10和TIMP-4在心力衰竭心室重构中的表达

目的:应用细胞因子抗体芯片技术筛选与心力衰竭心室重构关系密切的基质蛋白酶。方法:从本院的心脏病组织库中挑选6例病理诊断明确和各方面资料比较齐全的致心律失常性右室心肌病引起心力衰竭的心脏病标本(来源于心脏移植的受体),与年龄、性别和种族等因素相匹配的正常对照心脏组织(来源于心脏移植的供体)进行细胞因子抗体芯片分析,筛选在致心律失常性右室心肌病引起的心力衰竭中差异表达的基质蛋白酶,并应用酶联免疫分析和免疫组织化学的方法加以验证。结果:在所筛选的17种基质金属蛋白酶中,只有MMP-7和MMP-10在致心律失常性右室心肌病引起心力衰竭中高表达,而在4种基质金属蛋白酶内源性组织抑制剂中,只有TIMP-4 低表达。经酶联免疫分析和免疫组织化学的方法证实,不仅在致心律失常性右室心肌病引起心力衰竭的心肌,在缺血性心肌病和扩张性心肌病引起的心力衰竭心肌中也发现MMP-7和MMP-10 的高表达及TIMP-4的低表达。结论:心肌组织中MMP-7和MMP-10的高表达及TIMP-4的低表达在不同心肌病引起的心力衰竭心室重构分子机制中可能发挥重要的作用。     

犬间质来源细胞因子-1的基因克隆和体内分布及在急性心肌梗死中的表达变化

目的克隆犬间质来源细胞因子-1（Stromal derived factor-1，SDF-1）全长cDNA，并研究其在犬体内不同组织的表达分布情况及其在急性心肌梗死后的动态变化规律。方法用RT-PCR的方法克隆出犬SDF-1全长cDNA，经过双向序列测定加以确认。通过结扎冠状动脉左前降支制备犬急性心肌梗死模型。实验动物分为2组：心肌梗死组犬（MI组）和假手术组犬（S组），MI组再按观察时点随机分为2h，7d和4周，采用Real-timeRT-PCR检测SDF-1的mRNA表达情况，用HE染色观察心肌形态变化。结果（1）成功克隆犬SDF-1全长cDNA；（2）SDF-1在正常犬的心肌、脑、脾脏、肝脏、血管、肾脏、骨骼肌、睾丸和肺中均有构成性表达；（3）AMI后，心梗区的SDF．1mRNA的表达于2h开始下降，7d继续下降，4周开始回升，接近正常对照（假手术组）的水平，周围正常心肌于2h开始下降，7d开始回升，4周继续上升。心梗2h，SDF-1mRNA表达水平，心梗区高于周围正常区（P〈0．01），7d和4周时则低于周围正常区（P〈0．05）。结论SDF．1在正常的生理功能调节中具有重要的意义，它还可能与干细胞向缺血心肌的动员和归巢相关。     

大鼠心肌梗死后心肌中转化生长因子β诱导基因-22蛋白表达的变化规律及白细胞介素-6对其表达的诱导作用

目的:检测大鼠心肌梗死(心梗)后心肌组织中转化生长因子β诱导基因-22(TSC-22)蛋白水平表达的动态变化,并在细胞水平上研究白细胞介素-6(IL-6)是否对其蛋白表达有诱导作用.方法:雄性Sprague-Dawley大鼠,通过结扎左冠状动脉前降支制备心梗模型.分为心肌梗死模型组(心梗组)和假手术对照组(假手术组),于术后1天、3天、7天、2周、4周进行心脏标本取材,酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠左心室心肌组织中TSC-22蛋白的表达.胰酶消化法分离培养乳鼠原代心肌细胞,随机分为心肌细胞对照组和心肌细胞实验组,心肌细胞对照组正常培养,心肌细胞实验组分别在2.5、5.0、10.0 ng/ml浓度的IL-6刺激下培养24 h.采用ELISA法、免疫细胞化学法和免疫印迹法(Western blot)等方法检测TSC-22蛋白表达.结果:ELISA法结果表明,大鼠心肌梗死1天、7天心梗组比假手术组左心室心肌组织中TSC-22蛋白含量显著升高,4周时则显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).心肌细胞实验的ELISA法结果表明,在10.0 ng/ml的IL-6刺激24 h后,心肌细胞实验组比心肌细胞对照组TSC-22蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),在2.5、5.0 ng/ml IL-6刺激24 h后,心肌细胞实验组与心肌细胞对照组比较差异无统计学意义;免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法结果显示,10.0 ng/ml的IL-6刺激24 h后,TSC-22在细胞核中的染色明显加深.结论:大鼠心梗后的急性期,如梗死1天、7天后,左心室心肌组织中TSC-22蛋白水平迅速升高.炎症细胞因子IL-6可能是其在心梗后上调的诱导因素之一.     

低氧无血清诱导乳鼠心肌细胞胰岛素样生长因子2受体表达上调

目的研究胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)在体外模拟心肌缺血低氧环境时表达的变化。方法分离培养SD乳鼠心肌细胞,以低氧和无血清处理不同时间点后收获细胞,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时定量RT-PCR测定IGF-2RmRNA的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定IGF-2R蛋白水平。结果与对照组相比,低氧无血清处理12和24 h乳鼠心肌细胞IGF-2RmRNA表达显著增高(P<0.01),处理24 h后IGF-2R蛋白表达也升高(P<0.05)。结论低氧无血清可诱导乳鼠心肌细胞IGF-2R的表达,IGF-2R可能在缺血低氧引起心肌损害过程中发挥重要的作用。     

茶多酚EGCG通过SREBP2/LDLR通路调节HepG2细胞中的LDL摄取

目的探索茶多酚EGCG对人肝癌细胞HepG2中LDL的摄取情况的影响及其可能的分子机制。方法培养人肝癌细胞HepG2细胞,茶多酚EGCG刺激HepG2细胞,用Real-time PCR和western blot的方法分别检测LDLR的mRNA和蛋白水平表达以及核内蛋白SREBP2的表达情况。用DiI-LDL染色的方法检测LDL的摄取情况。另外,利用RNAi技术进一步检测SREBP2对LDLR的表达和LDL的摄取情况。结果 EGCG可增加LDLR的mRNA(P0.05)和蛋白水平(P0.01)的表达以及核内SREBP2(P0.01)的表达,可明显促进LDL的摄取。转染SREBP2的小干扰RNA后,可明显抑制EGCG引起的LDLR的表达(P0.01)及LDL的摄取。结论从细胞水平证明茶多酚EGCG可通过激活SREBP2/LDLR通路促进LDL的摄取。