应用抗SjP38的单克隆抗体建立血吸虫感染的胶体金免疫层析检测体系

目的 建立一种检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析方法.方法 将已获得的单抗用protein-G亲和层析纯化,通过间接ELISA测定每株单抗的亲和常数.按改良过碘酸钠标记法,8株单抗标记辣根过氧化物酶(HRP)后进行不同株单抗配对,选出亲和力高、稳定性强的单抗配对组合.胶体金标记株抗体,选择最佳反应模式,建立胶体金免疫层析方法,并对弓形虫感染鼠血样、血吸虫感染前和感染后2、3、、5、6周的鼠血样进行检测.结果 8株抗SjP38单克隆抗体经纯化后纯度达95%以上,其亲和常数介于1×10^-8mol/L～2.82×10^-10mol/L.根据配对实验,1A6与9H6、1A6与9G7、6G12与9H6、6G12与9G7以及9H6与9G7为最佳配对组合.标记1A6、6G12、9H6与9G7这株单抗后筛选出最佳反应模式,即以9G7为包被抗体,包被浓度为2.5μg/μl;当1A6为金标抗体,抗体稀释浓度为1:时,检测效果最佳.对rSjp38的最低检测量为12.5 ng/ml.抗检测感染3、、5、6周小鼠血清,阳性率分别为0%、50%、60%、80%,而弓形虫感染鼠和血吸虫感染前小鼠血样的检测结果为100%阴性.结论 通过抗体配对、最佳包被量和金标抗体稀释倍数条件的优化,建立了快速、简便、特异的胶体金免疫层析方法,自制的rSjP38试纸条能检测血吸虫早期感染鼠血清中的循环抗原SjP38.     

抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体（McAb）. 方法将pET32（a）-trSAG1重组质粒转化Escherichia coli BL21（DE3）,用0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性. 结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1, 轻链均为κ链;Western blot 分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合. 结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础.     

非放射性杂交标记系统

非放射性杂交标记分子的出现极大地促进了杂交技术的推广应用，对整个分子生物学都有深远的影响。本文介绍非放标记系统种类（半抗原类、荧光色素类及酶类）各自的原理及优缺点 并比较对其在原位杂交中的应用。     

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的　制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶 (GDH)的单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。　方法　用柱层析纯化的GDH/GST重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,用 protein G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,Westernblot分析其特异性。　结果　筛选出 6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,单抗均为IgG1,Westernblot分析显示 ,6株单抗都与重组的GDH发生特异性结合。　结论　制备的抗GDH杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗 ,为疟疾诊断技术的进一步研究奠定了基础。     

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb)，并对其特异性进行鉴定。方法 用柱层析纯化的GDH／GST重组融合蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株，用protein-G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，Western blot分析其特异性。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，单抗均为IgGl，Western blot分析显示，6株单抗都与重组的GDH发生特异性结合。结论 制备的抗GDH杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为疟疾诊断技术的进一步研究奠定了基础。     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

重组抗原用于血吸虫病免疫诊断研究进展

近年来,利用基因重组技术,对一些具有诊断价值抗原的组成及性质进行鉴定,使在诊断上极具潜能的蛋白通过基因的重组表达而大量合成,便于诊断应用.本文以血吸虫重组蛋白分子量大小为序,就近年来国内外有关重组抗原在血吸虫病诊断中的研究进展综述如下.     

抗人脑源性神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗人脑源性神经营养因子(BDNF)单克隆抗体。方法利用BDNF纯品与酸处理后的沙门氏菌菌体(抗原∶菌体为1∶5)混合免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。结果获得3株抗BDNF的单克隆抗体,分别命名为B1、B2和4D1,mAb的Ig亚类均为IgG1。ELISA间接法测定腹水mAb效价为1×10-6~1×10-5,各单抗相对亲和力结果为B2>B1>4D1。结论成功研制出抗人BDNF单克隆抗体,为进一步研究BDNF在体内组织的表达及分布提供了一种工具,并为基因工程制备BDNF提供了检测方法。     

白纹伊蚊miRNA的分离、鉴定及表达谱的初步分析

目的 通过Northern blotting方法验证白纹伊蚊microRNA的存在并分析其不同发育阶段的表达谱.方法 根据miRBase中冈比亚按蚊的已知miRNA序列设计合成6条特异的LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记.用mirVanaTM miRNA Isolation Kit分别提取白纹伊蚊卵、一二期幼虫、三四期幼虫、蛹、雄蚊、雌蚊等六个不同发育阶段的Total RNA,15%的尿素变性PAGE电泳分离小RNA,转膜、交联、杂交、检测.结果 共检测到5种miRNA的表达,其中包括3种保守的miRNA,2种蚊虫特异的miRNA,其表达方式既有组成型表达又有期特异性表达,如miR-184在各个阶段均有表达,let-7在幼虫后期才开始有表达,miR-9a主要在卵及幼虫阶段表达,miR-M1只在蚊虫卵期有表达,miR-1175在除卵期之外的其他阶段有表达而miR-1174未检测到有表达.结论 首次验证了白纹伊蚊中miRNA的存在,初步证明了miRNA在白纹伊蚊发育过程中的保守性和特异性,为白纹伊蚊胚胎生长、变态发育等生命进程的研究以及新的杀虫剂的研制提供了新的思路和方法.     

微培养一种敏感的皮肤利什曼病诊断方法

皮肤利什曼病(cutaneousleishmaniasis,CL)是热带、亚热带多发病。CL的诊断方法主要有:涂片法、组织活检、传统培养法(traditionalculture method,TCM)、免疫诊断方法ELISA等,这些方法敏感性不高(20%～50%)。近年来采用的PCR检测技术对急性患者检出率虽达到86%～95%,但对慢性患者敏感性较低(45.5%)。Allahverdiyev等对TCM进行改良,采用1mm×75mm血球容积毛细管替代TCM中使用的16mm×110mm组织培养管培养无鞭毛体,并且选择恰当的培养基,建立了微培养法(microculturemethod,MCM)。分别用TCM和MCM检测139例CL患者。标本经70%乙醇…