细粒棘球蚴原头节β_4微管蛋白的可溶性表达、纯化及生物信息学分析

目的对细粒棘球蚴原头节的β4微管蛋白(EgTub4)基因进行生物信息学预测和分析,并探索该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白。方法采用ProtParam、SMART、Predictprotein和Swiss-model软件分析EgTub4蛋白的理化性质和结构,采用SignalP4.1软件进行信号肽预测。提取细粒棘球蚴原头节的总RNA,并反转录成cDNA,PCR扩增EgTub4基因,构建原核重组表达载体pET28aEgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,进行酶切鉴定,并测序。探索重组蛋白rEgTub4可溶性表达的最佳诱导条件[表达载体、诱导温度(T)、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间(t)和培养基类型]。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblotting)。结果经生物信息学分析预测EgTub4蛋白理论等电点(pI)值为4.79,理论相对分子质量(M_r)为49700;EgTub4不含信号肽,含有3个结构域,分别为微管蛋白GTPase结构域、C末端结构域和卷曲螺旋区。成功构建了重组质粒pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,经双酶切后,均可得到与目的基因相对分子质量相符的片段,测序正确。经Westernblotting分析,在表达质粒pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中重组蛋白分别为M_r56000、60000、68000。EgTub4基因在pET28a(+)中表达时不可溶,主要以包涵体形式存在,需要在变性条件下进行纯化。而在pET30a(+)和pET32a(+)中表达时均部分可溶,可以在非变性条件下进行纯化。综合考虑,本研究最终选择pET30a(+)作为EgTub4基因的表达载体。目标蛋白可溶性表达的优化条件为:T=25℃、[IPTG]=0.01mmol/L、t=10h、2×YT培养液。最佳洗杂咪唑浓度为150mmol/L,洗脱咪唑浓度为500mmol/L。Western blotting分析结果显示,纯化的蛋白均能与β-微管蛋白抗体及His-Tag标签抗体反应,条带大小符合预期,约M_r 60000。结论对EgTub4进行了生物信息学预测、分析和表达,得到该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白。     

小鼠口服3种苯并咪唑类药物的油酸、大豆油和1%西黄耆胶混悬剂的药动学

 目的 观察3种苯并咪唑类药物（阿苯达唑、芬苯达唑或氟苯达唑）的3种混悬剂（油酸、大豆油和1%西黄耆胶的混悬剂）在小鼠体内的药动学参数及其在相应介质中溶解度和生物利用度的相关性。方法 用球磨机制备阿苯达唑、芬苯达唑或氟苯达唑在油酸、大豆油和1%西黄耆胶的混悬剂（作对照剂型）。每组45～54只小鼠1次口服1种上述的苯并咪唑类药物混悬液,剂量除阿苯达唑选用100 mg·kg^-1外,其余芬苯达唑和氟苯达唑均为50 mg·kg^-1,并于给药后0.25～24 h的不同间隔时间取血,用高效液相色谱法测定血药浓度,用DAS程序计算3种苯并咪唑类药物的药动学参数。结果 小鼠口服3种苯并咪唑类药物在油酸、大豆油和1%西黄耆胶混悬剂后,阿苯达唑的平均滞留时间(MRT)分别为(3.91±0.29)、(3.70±0.09)和(1.59±0.14) h,峰浓度(ρ_max)分别为(0.66±0.08)、(0.29±0.05)和(0.34±0.09) mg·L^-1,药物浓度-时间曲线下面积(AUC)分别为(3.19±0.40)、(1.25±0.09)和(0.50±0.05) mg·L·h^-1,相对生物利用度F(油酸或大豆油混悬剂组的AUC与1%西黄耆胶混悬剂组AUC之比,下同)分别为6.38和2.50;芬苯达唑的MRT分别为(5.72±0.14)、(4.83±0.38) 和(3.85±0.25)h,ρ_max分别为(0.70±0.11)、(0.20±0.05)和(0.12±0.03) mg·L^-1, AUC分别为(5.02±0.73)、(1.08±0.21)和(0.52±0.07) mg·h·L^-1,F分别为9.65和2.08;氟苯达唑的MRT分别为(5.71±0.37)、(4.59±0.39)和(3.34±0.20)h,ρ_max分别为(0.93±0.14)、(0.58±0.09)和(0.41±0.09) mg·L^-1, AUC分别为(6.90±0.73)、(3.33±0.39)和(1.94±0.55) mg·h·L^-1;F分别为3.57和1.72。结论 小鼠一次口服阿苯达唑、芬苯达唑或氟苯达唑的2种油相混悬剂后,与1%西黄耆胶混悬剂相比,其药动学参数明显改善,延长了MRT,提高了ρ_max,同时增加了AUC和F,而且3种苯并咪唑类药物在3种介质中的溶解度与其在小鼠体内的MRT、ρ_max、AUC基本呈正相关。     

4种苯并咪唑类药物在4种油性分散介质中的溶解度

目的探讨4种苯并咪唑类药物(阿苯达唑,丙氧咪唑,芬苯达唑和氟苯达唑)分别在4种油性分散介质中的溶解度。方法应用高效液相色谱法(HPLC)测定4种苯并咪唑类药物的溶解度。结果在分散介质油酸、油酸油醇脂、油酸乙酯、大豆油和水中,阿苯达唑的溶解度分别为(3414±38)、(72.5±2.9)、(57.2±4.4)、(139±8)和(0.63±0.04)μg/mL;丙氧咪唑的溶解度分别为:(3774±106)、(86.7±5.2)、(62.7±7.4)、(10.7±0.5)和(1.4±0.1)μg/mL;芬苯达唑的溶解度分别为:(1790±47)、(258±17)、(376±36)、(197.2±1.9)和(11.4±0.3)μg/mL;氟苯达唑的溶解度分别为:(427±32)、(16.9±0.1)、(26.4±2.3)、(5.8±0.4)和(0.04±0.00)μg/mL。结论 4种苯并咪唑类药物在油酸中的溶解度远较其他油相的为高。     

他克林对多房棘球蚴抑制作用的实验研究

目的观察他克林体外抗多房棘球蚴的作用以及抗小鼠多房棘球蚴感染的疗效。方法在含50~200个多房棘球蚴原头节的96孔板中加入浓度为100.00、50.00、25.00、12.50和6.25μmol/L的他克林,给药后1、3、5和7 d用亚甲基蓝法测定原头节的活性。同时用细胞增殖-毒性检测(CCK-8法)测定他克林对3种正常宿主细胞(L929细胞、HK-2细胞和Chang liver)以及3种肿瘤细胞(A172细胞、A2058细胞和HCT-8细胞)的细胞毒性。40只感染多房棘球蚴6个月的BALB/c小鼠随机均分为4组,分别为30 mg/kg他克林组、15 mg/kg他克林组、25 mg/kg甲苯达唑组和1%西黄芪胶对照组。各组小鼠连续灌胃给药28 d,停药14 d后处死小鼠,剖取小鼠体内多房棘球蚴囊,称取囊重并计算囊重抑制率,采用SPSS 17.0中的非参检验法进行统计学分析。结果他克林体外对多房棘球蚴原头节的作用呈现明显的剂量效应关系,随着药物浓度和培养天数的增加,原头节的活性显著降低。100μmol/L的他克林作用3 d后,原头节全部死亡且形态发生强烈改变,难以观察到完整的超微结构。他克林作用7 d后,100.00、50.00、25.00、12.50和6.25μmol/L组的原头节死亡率分别为(100±0)%、(91.2±2.5)%、(80.3±5.1)%、(71.6±2.4)%和(51.7±2.9)%。他克林对正常宿主细胞活性影响较小,药物浓度增加至250.0μmol/L,对L929细胞、HK-2细胞和Chang liver细胞的活性抑制率分别为(27.6±4.7)%、(29.6±3.9)%和(26.9±2.1)%。但是对肿瘤细胞的细胞毒性较大,A172细胞、A2058细胞和HCT-8细胞的半数抑制浓度(Tox50)分别为(178.2±3.2)、(133.2±5.2)和(128.8±4.0)μmol/L。30 mg/kg他克林组、15 mg/kg他克林组和25 mg/kg甲苯达唑组囊重抑制率分别为-3.4%、9.4%和38.2%,上述各组小鼠体内多房棘球蚴囊重的减少与1%西黄芪胶组相比均无统计学意义(P0.05)。4组小鼠在实验周期中分别有3、6、2和5只死亡,相较于其他组,25 mg/kg甲苯达唑和15 mg/kg他克林治疗增加了感染实验鼠的生存率。结论他克林可直接影响体外培养的多房棘球蚴原头节的活性,可提高多房棘球蚴感染小鼠的生存率。     

甲苯达唑治疗棘球蚴病的疗效、代谢及生物利用度的研究进展

甲苯达唑是治疗棘球蚴病的有效药物,但其肠道吸收差,生物利用度低。为了提高甲苯达唑的生物利用度和疗效, 近年来对其剂型进行了一些研究。本文综述有关这方面的研究进展。     

甲苯达唑在不同介质中的溶解度研究

目的 研究甲苯达唑在几种油相和水相介质中的溶解度,通过观察溶解度的变化情况,为药物生物利用度的提高奠定基础.方法 将甲苯达唑分散于大豆油、甘油三油酸酯以及油酸等9种油相介质中,并以1％西黄耆胶和去离子水作为对照,于25℃或37℃的恒温水浴中以100 r/min的速度机械振荡24 h后离心,取上清液采用高效液相色谱法(HPLC)测定甲苯达唑在上述介质中的浓度.结果 在25℃时甲苯达唑在大豆油、甘油三油酸酯以及油酸中的溶解度分别为(2.1±0.2)μg/ml、(54.1±1 9)μg/ml以及(329.4 +9.7) μg/ml,均高于在去离子水(1.0±0.1) μg/ml和1％西黄芪胶(5.5±0.7) μg/ml的溶解度.当介质温度升高到37℃,甲苯达唑在上述溶剂中的溶解度均随着介质温度的升高而增加,其中在3种油相中的溶解度为(34.1 ± 1.9) ～(900.7±57.1)μg/ml,而在1％西黄耆胶和去离子水中增加到(7.2±0.7)μg/ml和(3.7±1.2)μg/ml.结论 与传统的水相给药介质相比,将甲苯达唑分散于油相溶剂中,可显著增加其溶解度.     

他克林体外抗细粒棘球蚴作用研究

目的 研究乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林体外抗细粒棘球蚴的作用效果。方法 体外分离和培养细粒棘球蚴原头节和生发层细胞,经浓度为4、8、10、20和40 μg/mL的他克林作用3 d后经0.1%亚甲基蓝染色观察,记录死活原头节的数目以计算原头节死亡率,另外用CCK-8试剂盒检测药物对生发层细胞活性的影响并计算细胞活性抑制率。同时用透射电镜和扫描电镜分别观察药物对细粒棘球蚴原头节和生发层细胞超微结构造成的影响。结果 经20 μg/mL和40 μg/mL的他克林体外作用3 d后,原头节的死亡率高达100%,其中死亡原头节的体壁出现轻微肿胀且伴随着外部轮廓的消失,同时超微结构亦发生明显改变,原头节体壁组织中出现了大量的空泡和脂肪滴。当他克林浓度为40 μg/mL时,可造成生发层细胞全部死亡。细粒棘球蚴生发层细胞粘附于培养介质的基质消失、细胞发生聚集且数目减少。扫描电镜可观察到他克林作用3 d后的细胞出现塌陷或者萎缩。结论 他克林可直接影响体外培养的细粒棘球蚴原头节和生发层细胞的活性,是潜在的包虫病治疗药物。