5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景：在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。 目的：对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成。 材料：骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病。 方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性。用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400 感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察。 主要观察指标：流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例。 结果：人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%。人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性。Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400 感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%;后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%。在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上。在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下。 结论：Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体。     

EGFP-CD40L 融合基因的构建、表达及功能鉴定

目的 构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells, DCs)表型和功能的影响. 方法 以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段.小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1 SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L.用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达.Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌. 结果 pcDNA3.1 sEGFP或pcDNA3.1 sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Western blot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白.sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2 h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24 h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响. 结论 用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌.     

慢性嗜酸性粒细胞白血病1例并文献分析

目的:介绍和分析1例慢性嗜酸性粒细胞白血病,从而分析总结该病的临床特点.方法:回顾性分析1例慢性嗜酸性粒细胞白血病患者的临床资料.结果:本病临床特点主要为贫血以及嗜酸细胞破坏后释放出大量细胞因子引起全身各脏器损害的相关症状,细胞遗传学改变为血小板衍生的生长因子受体基因(FIPlLl/PDGFRa)阳性,预后不佳,患者放弃治疗.结论:嗜酸性粒细胞白血病的临床特点除有白血病表现外,主要为嗜酸细胞浸润各脏器,遗传学上有嗜酸性粒细胞克隆性增殖的表现.     

脂氧合酶在铁死亡驱动阿尔茨海默病中作用的研究进展

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知功能下降为主要特点的神经退行性疾病。铁死亡是一种与神经退行性疾病相关的新型细胞调控性死亡方式,其中包括AD。铁死亡的核心过程是脂质过氧化引起细胞死亡,而脂氧合酶（LOX）在介导脂质过氧化方面发挥了重要作用。此外,脂质机制/途径的失调与许多神经退行性疾病有关,AD就是其中之一。越来越多的研究表明,LOX与AD的关系密切,LOX表达水平在AD患者大脑中升高,对β-淀粉样蛋白（Aβ）及Tau蛋白代谢、突触完整性及认知功能有一定影响。本文旨在分析LOX在铁死亡驱动AD中的关键作用,重点包括LOX的代谢过程、LOX与AD的关系、LOX抑制剂对AD的作用。     

人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明,白细胞介素12是一种强有力的抗肿瘤细胞因子,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,因此,利用携带白细胞介素12基因的间充质干细胞对于肿瘤的治疗具有极大的发展前景.目的:构建人白细胞介素12 5型腺病毒载体(Ad hIL-12),感染人骨髓间充质干细胞,检测白细胞介素12的表达.方法:提取成熟的树突状细胞的总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒.采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12.Ad hIL-12感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使细胞失去增殖能力,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中白细胞介素12的水平.结果与结论:经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882(762 bp)和NM_002187(987 bp)提供的序列完全一致.用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染人骨髓间充质干细胞后可持续高水平分泌白细胞介素12,在以人骨髓间充质干细胞为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景.     

人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的：构建人白细胞介素12（Human interleukin-12, hIL-12）5型腺病毒载体（Ad hIL-12）,感染人骨髓间充质干细胞（Human bone-marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）,检测IL-12的表达,为IL-12临床应用方式的改进奠定基础。 方法：实验于2009-05/2009-12在解放军北京军区总医院生物治疗中心实验室完成。人树突状细胞（Dendritic cells, DCs）经细菌脂多糖（LPS）处理24 h后提取DCs总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)和pmRNA IRES中;然后再亚克隆至腺病毒载体穿梭质粒pDC515,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点（Internal ribosomal entry sites, IRES）连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒。采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrtE1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12。常规培养hBMSCs,第三代hBMSCs按每孔5105细胞接种至12孔板中,Ad hIL-12按每个细胞100 pfu的感染复数（MOI）感染hBMSCs 2 h后经10 Gy 射线照射使hBMSCs失去增殖能力,每24 h更换一次培养液,收集1-5天的细胞培养上清,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中hIL-12的含量。 结果：经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882（762 bp）和NM_002187（987 bp）提供的序列完全一致。pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞约10天左右细胞开始有空斑（plagues）形成,挑取明显的空斑接种至293细胞,经过2-3轮扩增后,收集293细胞冻溶裂解,提取DNA进行PCR鉴定,分别获得hIL-12 p40和p35 PCR片段,证实冻溶裂解物中含有hIL-12 p40和p35基因DNA片段。纯化的病毒按100 pfu/细胞的MOIs感染hBMSCs,ELISA检测12 h即有IL-12的分泌,至24-48 h表达量到达高峰,并持续表达至第五天表达水平仍无下降趋势,12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h hIL-12表达量分别为(4.91±0.09) 、(59.40±1.17) 、(106.88±1.64) 、(144.53±3.10)、(182.72±0.14)和(205.83±0.14) ng/106细胞/24 h。 结论：用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染hBMSCs后可持续高水平分泌hIL-12,在以hBMSCs为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景。     

砷剂治疗非APL型恶性血液病初步报告

目的:探讨砷剂治疗非急性早幼粒细胞白血病(APL)型恶性血液病的临床疗效。方法:对38例患者进行治疗前后监测临床表现、血常规、骨髓象和染色体等指标变化。一般为亚砷酸10mg,静脉滴入1次/d,连续4周,针对病种情况同时化疗及其他辅助治疗。结果:所有患者均有明显血液学反应,临床症状有不同程度的改善,部分患者获得缓解。结论:砷剂治疗非APL型恶性血液病是有效的治疗方法,使其缓解有效率有明显提高,是非APL型恶性血液病治疗的一个方向,值得临床进一步应用研究。     

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.     

宁心止动汤治疗儿童抽动障碍疗效观察

目的 观察宁心止动汤治疗儿童抽动障碍的临床疗效,并与阿立哌唑进行比较。方法 选取2021年1月—2022年12月于南阳市中医院儿童神经康复门诊就诊的抽动障碍(tic disorder, TD)患儿55例,将其随机分为治疗组(28例)和对照组(27例),治疗组给予宁心止动汤治疗,对照组给予阿立哌唑片治疗,2组疗程均为12周。观察并比较2组耶鲁综合抽动严重程度量表(Yale global tic severity scale, YGTSS)积分、注意缺陷多动障碍评定量表(Swanson, Nolan, and Pelham, version IV scale, SNAP-IV)积分、中医证候积分以及儿童睡眠障碍评分变化;随访6个月,比较复发率以及恶心、呕吐、困倦等不良反应和肝功能、心电图等安全性指标,并比较2组的临床总有效率。结果 55例患儿中脱落及剔除5例,有50例完成了全部指标的观测,其中治疗组26例,对照组24例。对照组临床总有效率为70.83%,治疗组为92.31%,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组治疗后YGTSS积分、SNAP-IV量表积分、中医证候积分、...     

N6-腺苷酸甲基化干预细胞增殖分化在神经系统疾病中的进展

N6-甲基腺苷(m6A)修饰通过转录后水平影响RNA代谢(包括稳定性、转运、剪接和翻译),控制基因表达,参与下游生物效应。近年来发现结构重塑后的mRNA在中枢发育中高度调控,包括脑组织发育障碍、神经细胞增殖分化异常与神经损伤修复等。m6A修饰及其相关因子的动态平衡与神经系统疾病的发生发展及预后密切相关,异常时导致脑血管疾病、神经退行性疾病及精神类疾病等中枢性疾病。本文介绍了m6A甲基化修饰因子以及干预细胞增殖分化的最新研究进展,并探讨了m6A介导基因表达在神经发育和神经系统疾病中的作用。