Salinomycin对乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/DOX的增殖抑制作用及机制

目的本研究旨在探讨Salinomycin对乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/DOX增殖和凋亡的影响及可能作用机制。方法 MTS实验检测Salinomycin对MCF-7/DOX细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI染色检测Salinomycin对MCF-7/DOX耐药细胞凋亡的影响;DCFH-DA染色检测Salinomycin对MCF-7/DOX耐药细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的影响;JC-1法测定细胞线粒体膜电位;Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、caspase-3和caspase-9的表达变化。结果 Salinomycin能明显抑制MCF-7/DOX耐药细胞增殖,且具有浓度依赖性;流式分析发现Salinomycin能够诱导MCF-7/DOX细胞凋亡,增加细胞内ROS水平,降低细胞线粒体膜电位;与对照组相比较,Salinomycin处理明显抑制BCL-2的表达,上调BAX、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表达;抗氧化剂N-acetylcysteine(NAC)则逆转上述作用。结论 Salinomycin能够诱导MCF-7/DOX细胞凋亡,其机制可能与Salinomycin诱导ROS的产生,激活线粒体凋亡途径有关。     

一种BRAF基因突变检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.     

酯型儿茶素单体EGCG和GCG对人肠癌SW480细胞生长抑制作用及其机制

目的　以聚酯型儿茶素 (TS)为阳性对照 ,探讨其单体EGCG和GCG对人肠癌SW480细胞的生长抑制作用及其机制。方法　应用MTT法、软琼脂集落形成试验、Hoechst 3 3 2 5 8染色法和流式细胞术等方法探讨药物对细胞生长抑制作用。结果　单体EGCG和GCG与TS对SW 480细胞均呈剂量依赖性的抑制作用 ,其IC5 0值分别为 10 8 88、183 2 1、83 3 6μg·ml-1;以IC5 0浓度作用于SW 480细胞 2 4h后 ,EGCG、GCG、TS组的集落形成率显著低于对照组 (P <0 0 1) ;Hoechst 3 3 2 5 8染色观察到EGCG、GCG、TS组细胞出现明显的核浓缩或碎裂 ,其凋亡细胞比率显著高于对照组 (P <0 0 1) ;流式细胞术分析亦显示EGCG、GCG、TS组诱导的细胞凋亡率分别为对照组的 1 62、1 2 3、1 66倍。结论　与TS一致 ,EGCG、GCG对肠癌SW480细胞的生长有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。     

磷酸化蛋白质组学技术及其在肿瘤研究中的应用

磷酸化蛋白质组是指机体细胞在特定时间和空间上表达的所有磷酸化蛋白质;磷酸化蛋白质组学是在整体水平上研究磷酸化蛋白质在细胞中的组成成分、表达水平、修饰状态及相互作用规律的学科.近年来,磷酸化蛋白质学技术已广泛应用于肿瘤研究,为阐明肿瘤的发生机制,提高肿瘤的诊治水平提供了重要信息.     

TCRP1在口腔鳞癌中介导顺铂耐药的体内实验研究

目的 TCRP1是新近从舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中克隆出来的一个新基因,前期体外实验研究表明TCRP1在口腔鳞癌细胞中能特异地介导对顺铂化疗耐受,本研究将进一步探讨TCRP1在体内实验中介导化疗耐受的作用。方法通过建立TCRP1过/沉默表达裸鼠移植瘤模型,观测TCRP1对化疗药物5-Fu、cDDP的作用敏感性的影响并初步探讨其机制。结果肿瘤生长曲线及肿瘤瘤重结果显示TCRP1能增强裸鼠移植瘤对顺铂的耐药性,而对5-Fu则没有影响。TUNEL检测发现TCRP1高表达的组织中凋亡细胞计数更少。结论 TCRP1是一个新的耐药相关基因,其作用机制与通过增强口腔鳞癌细胞凋亡抗性有关。     

人鼻咽上皮细胞CYP2E1 cDNA克隆及序列分析

目的 :比较正常人胚鼻咽上皮 (HENE)细胞、二亚硝基哌嗪转化的人胚鼻咽上皮 (HENE)所建的细胞系( 742 9)、鼻咽癌细胞系 (HNE1)细胞色素P45 0 2E1(CYP2E1)mRNA表达序列 ,探讨CYP2E1在鼻咽癌变过程中的作用特点。方法 :采用RT PCR方法和DNA重组技术从HENE ,742 9,HNE13种细胞系中克隆的CYP2E1cDNA片段 ,测序并分析其结构改变特征。结果 :①与HENE 2E1比较 ,742 9 2E1存在 846位 (A→T)、90 1位 (A→G)两个点突变 ;HNE1 2E1存在 90 1位 (A→G)一个点突变。②与成人肝来源的CYP2E1CDs序列 (GenBank号为J0 2 843)比较 ,发现HNE1 2E1序列与其完全匹配 ;HENE 2E1序列存在 90 1位 (G→A)点突变。但上述突变对应部位氨基酸序列并无改变。结论 :鼻咽癌发生过程中CYP2E1基因cDNA序列仅存在少数无义突变 ,表现出其高度保守性。     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高（9．39×10^1copies／uL）,重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1．60％、2．54％）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法。     

HLCDG1基因siRNA表达质粒的构建及其对A549细胞周期和增殖的影响

目的:本研究旨在应用RNA干扰技术，诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。 方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体，筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。 结果:根据siRNA表达载体的设计原则，构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个（4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组），依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4 和 pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染A549细胞，筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的A549细胞，它几无HLCDG1基因表达，这株细胞暂命名为A549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明，A549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高，进入S期和G2+M期增多，滞留G1期减少。 结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达，验证了HLCDG1基因对A549肺癌细胞有生长抑制作用。     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高(9.39×101copies/uL),重复性好(实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1.60%、2.54%)。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100%。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法。     

细胞色素P450 2E1在人鼻咽部的表达及体外表达模型的建立

细胞色素P4502E1是细胞色素P450（CYPs）超家族的主要成员之一,参与内源性固醇类、脂肪酸和外源性的药物;酒精及化学致癌物的代谢。亚硝是一类环境中广泛存在的间接致癌物,它在体内的代谢活化主要由CYP2E1介导。本室早些时候曾应用二亚硝基哌嗪（DNP）体外诱导人胚鼻咽上皮细胞恶性转化获得成功,因此推测在鼻咽部可能存在DNP的代谢活性酶。本文采用RT－PCR对8例人胚鼻咽上皮细胞（HENE）、1例恶性转化鼻咽细胞系（7429）、5例鼻咽癌细胞系（CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3）和10例鼻咽癌（NPC)活检组织CYP2E1表达检测后,结合Western blot对CNE2的CYP2E1表达分析,首次发现了CYP2E1在鼻咽组织的表达。同时,发现200μg/ml-300μg/ml DNP能使CYP2E1cDNA在HENE细胞表达明显增强。这些结果提示CYP2E1可能在DNP诱发的正常人胚鼻咽上皮细胞恶性转化中起作用。基于CYP2E1在化学致癌物遗传毒理学中的重要作用,为进一步对其肿瘤发生相关功能研究的需要,我们采用基因重组的方法构建了人CYP2E1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-2E1,经脂质体Lipofectamine介导分别转入NIH3T3和CNE2细胞系,通过G418筛选后随机挑选若干抗性克隆扩大培养,建成稳定传代的转染细胞株,利用PCR和Southern blot对各转染细胞克隆外源基因整合情况进行了鉴定,结果显示有4个克隆NIH3T3－A4、NIH3T3－A8、CNE2－R12、CNE2－R18呈Southern杂交阳性,且经RT－PCR及Western blot分别证实了外源基因的稳定表达。说明人CYP2E1 cDNA真核表达细胞株的建立成功。用乙醇及DNP分别对此模型进行诱导后的表达检测发现CYP2E1蛋白水平的增加主要与mRNA水平增高有关,可能是二者介导了CYP2E1的转录活化或mRNA的稳定。可以预见,CYP2E1cDNA真核表达细胞株的建立将为CYP2E1相关的化学致癌机制的阐明打下坚实基础。