AFP基因特异性miRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因的miRNA表达质粒,为进一步研究AFP基因功能奠定基础.方法 沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的19个核苷酸,通过同源性比较,选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的miRNA靶位点,针对AFP基因的编码序列体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAi EXPRESSION VECTOR载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、PCR及基因测序鉴定其相对分子质量及插入片段的序列.结果 纯化质粒的相对分子质量为5.8 kb,PCR鉴定结果符合目的 条带(260 bp左右)大小,插人的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符.结论 成功构建了针对人AFP基因的miRRA表达质粒.     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体.目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成.材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.(Canada)公司产品.方法:选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定.结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致.重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109 nfu/L.结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒.     

FUT3基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

背景：研究发现，Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切，岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase ,FUTs)是参与合成Lewis抗原的关键酶，FUT3是其中之一。 目的：设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒，为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-05/10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。 材料：BLOCK-iT TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits (含荧光基因 GFP) 、T4 DNA连接酶购自invitrogen公司；大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。 方法：根据GenBank中FUT3的序列，应用www.invitrogen.com网站的设计软件设计、合成针对FUT3 miRNA的相应Oligo DNA，退火后与BLOCK-iT TM Pol II miR RNAi Expression Vector相连接，转化感受态 E.coli TOP10 。 主要观察指标：①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。 结果：经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FUT3基因的miRNA干扰质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP- FUT3-miR；质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。 结论：FUT3 靶向miRNA表达载体构建成功。     

腺病毒介导RNAi抑制胃癌FU97细胞AFP基因表达的研究

目的:研究甲胎蛋白特异siRNA腺病毒载体对人甲胎蛋白阳性胃癌细胞FU97AFP基因的抑制作用,及抑制甲胎蛋白基因后对此肿瘤细胞周期及凋亡的影响.方法:利用构建好的腺病毒Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA载体转染入FU97细胞,筛选出最佳感染复数.结果:筛选出最佳感染复数为:MOI=100;Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA转染细胞后能显著抑制AFP基因在mRNA和蛋白水平的表达,G0/G1期细胞百分率[(33.49±1.85)%]明显低于空载体对照组和空白对照组[(64.76±2.98)%和(74.81±2.60)%,P<0.01],G2/S期[(64.10±2.59)%]显著高于空载体组和空白对照组[(34.77±1.91)%和(29.85±2.85)%],P<0.01;凋亡分析,实验组与各对照组之间凋亡发生差异无统计学意义,P>0.05.结论:重组腺病毒介导的RNA干扰能够显著抑制AFP在FU97中mRNA水平和蛋白水平的表达;抑制AFP后,影响细胞增殖周期,但对细胞凋亡无影响.     

自身免疫性甲状腺炎大鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞变化及意义

目的研究CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞在自身免疫性甲状腺炎（AITD）大鼠外周血中的比例变化,并初步探讨其在疾病进程中的意义。方法选取17例A1TD大鼠,取静脉血,应用流式细胞术及定量PCR的方法,分别在蛋白质和mRNA水平检测Foxp3^＋表达,并与甲状腺炎球蛋白抗体（TgAb）,甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）,甲状腺微粒体抗体（TmAb）和甲状腺组织活检结果作相关分析。取正常大鼠作为对照。结果AITD大鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（5．35％±1．27％）显著低于正常对照组（8．02％±2．29％,P〈0．01）,AITD大鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞占CD4‘T细胞比例（3．12％±0．78％）明显低于正常对照组（6．45％±2．12％,P〈0．01）,AITD大鼠Treg与TgAb、TmAb、TPOAb呈负相关（r=-0．291,-0．357,-0．389,P〈0．05,0．05,0．05）,并与小鼠甲状腺组织的炎症程度呈负相关（r=-0．511,P〈0．01）;Foxp3mRNA表达水平与蛋白质表达水平变化相一致。结论AITD大鼠CD4^＋CD25^＋T细胞明显减少,这群调节性T细胞可能参与了AITD的病理进程。     

三氧化二砷对人AFP阳性胃癌细胞株FU97的作用及其机制

目的研究三氧化二砷（As2O3）抑制AFP阳性胃癌（alpha-fetoprotein-producing gastric carcinoma.APGC）细胞株FU97增殖、诱导凋亡及其机制。方法MTT法检测药物效应;DNA凝胶电泳和流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡;化学发光法、实时荧光定量PCR及ELISA检测AFP、STAT3、VEGF表达变化。结果As2O3可明显抑制FU97细胞增殖,且呈时间和浓度依赖关系;DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征性梯状条带;FCM检测在细胞周期G1期前出现亚二倍体凋亡峰;细胞周期分析显示G2／M期阻滞;化学发光法、免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR以及ELISA结果证实As2O3可下调FU97细胞AFP、VEGF、STAT3基因的表达。结论As2O3可抑制FU97细胞的增殖、阻滞细胞周期进程诱导凋亡。同时通过下调AFP、VEGF、STAT3基因的表达阻止APGC的恶性进程。     

FUT3基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

背景：研究发现，Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切，岩藻糖基转移酶（fucosyltransfemse，FUTs）是参与合成Lewis抗原的关键酶，FUT3是其中之一。目的：设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒，为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-05，10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。材料：BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits（含荧光基因GFP）、T4DNA连接酶购自invitmgen公司；大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。方法：根据Gen Bank中FUT3的序列，应用www．invitrogen．com网站的设计软件设计、合成针对FUT3miRNA的相应Oligo DNA，退火后与BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector相连接，转化感受态Ecoli TOP10。主要观察指标：①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。结果：经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FuT3基因的miRNA干扰质粒pcDNA^TM 6．2-GW／Em GFP-FuT3-miR；质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。结论：FUT3靶向miRNA表达载体构建成功。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。