普洛迪(曲克芦丁脑蛋白水解物注射液)治疗缺血性卒中的随机、多中心临床研究

目的大样本观察普洛迪治疗急性缺血性卒中的临床效果和安全性。方法选择934例符合诊断标准的急性前循环脑梗死患者，随机分为两组，在给予基础治疗的原则下，治疗组给予普洛迪静脉滴注，对照组给予复方丹参注射液静脉滴注。观察治疗前、治疗后第7、14、90天的临床有效率、神经功能缺损评分（NIH）、改良Rankin量表评分、Barthel指数改变、实验室生化指标变化、不良反应等指标。结果治疗组基本痊愈195例（30．76％），显著进步326例（51．42％），进步90例（14．20％），无变化22例（3．47％），恶化1例（0．15％），总有效率96．38％；对照组基本痊愈48例（16．00％），显著进步80例（26．67％），进步95例（31．67％），无变化76例（25．33％），恶化1例（0．33％），总有效率74．34％；治疗组有效率显著高于对照组。治疗前后治疗组及对照组的实验室生化指标均无明显变化，实验室生化检查数据显示治疗组安全性略高于对照组，两组均无明显相关的严重不良反应。结论普洛迪治疗缺血性卒中有效、安全。     

氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用

目的:观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)后小胶质细胞BV-2 Toll样受体9(TLR9)激活对神经元凋亡的影响。方法:对BV-2细胞或TLR9-siRNA转染的BV-2细胞进行OGDR处理4 h后,将细胞上清添加至OGDR处理4 h的小鼠原代皮层神经元中,继续正常培养24 h后,倒置显微镜下观察神经元形态变化,TUNEL染色检测神经元凋亡,Western blotting检测神经元caspase-3蛋白的表达。实验分为正常BV-2组、negative control-siRNA组、TLR9-siRNA组、OGDR组、OGDR+NC-siRNA组、OGDR+TLR9-siRNA组和对照组(神经元OGDR后不添加BV-2细胞上清)。结果:OGDR后神经元胞体肿胀,折光性下降,出现空泡样变,轴突变细、扭曲、断裂。TUNEL染色各组均可见绿染凋亡小体。与对照组比较,其它组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);与正常BV-2组比较,OGDR组和TLR9-siRNA组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);OGDR+TLR9-siRNA转染组与TLR9-siRNA转染组和OGDR组比较,caspase-3蛋白表达下降(P0.05)。结论:OGDR后BV-2细胞TLR9激活致神经元凋亡增多,caspase-3蛋白表达升高;抑制TLR9表达后,神经元损伤减轻。     

小鼠脑梗死后小胶质细胞内Toll样受体9选择性上调

 目的：观察脑梗死后Toll 样受体9（TLR9）表达量及其在神经元和神经胶质细胞中的表达变化。方法：线栓法制备C57小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,90 min后再灌注。假手术组为对照。再灌注后6 h、3 d、7 d和14 d处死动物 (n=3),制备脑冠状位冰冻切片。免疫荧光染色观察TLR9表达量及其在神经元和神经胶质细胞中的表达变化。结果：梗死灶边缘区TLR9的表达量随时间增加,始终高于对侧及假手术组。病变全程偶见神经元胞内小点状TLR9,TLR9阳性率无时间、组间差异。激活态小胶质细胞聚集于梗死灶边缘区,胞内TLR9由散在小点状变为团块状粗颗粒样。TLR9阳性率随时间先升后降,始终高于对侧及假手术组。星形细胞和少突胶质细胞未见TLR9阳性染色。结论：脑梗死后,中枢定居细胞中神经元TLR9维持固有表达,仅小胶质细胞TLR9表达选择性上调,星形细胞及少突胶质细胞无TLR9表达。     

Kallikrein基因转导对脑缺血再灌注后局部血流灌注恢复的作用

目的 探讨Kallikrein基因对脑缺血再灌注后梗死灶周围血管增生与局部脑血流灌注恢复的作用.方法 建立大鼠脑缺血再灌注模型,术后将90只大鼠按照随机数字表法分为3组.每组30只,分别是空白对照组、注射生理盐水、注射pAdCMV-人组织激肽释放酶(HTK)组.各组大鼠又分为治疗后12 h、24 h及72 h组,每组各10只.治疗前后行大鼠神经功能缺损评分.TTC染色方法测定脑梗死面积的变化,用免疫组化检测外源性HTK的表达以及局部血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并通过14C-iodoantipyrine微示踪技术检测局部脑血流灌注(rCBF)情况.结果 与其他两组相比,pAdCMV-HTK组大鼠脑梗死面积在治疗后24h已有明显减小,72h后这种变化更明显,差异有统计学意义(P<0.05);在治疗后24 h,pAdCMV-HTK组大鼠神经功能缺损评分明显低于生理盐水组及空白对照组,治疗后72h差异更明显,差异有统计学意义(P<0.05).vEGF阳性细胞主要分布于脑梗死灶周边皮质与部分白质;pAdCMV-HTK组VEGF表达在治疗后12h、24h、72h均明显高于生理盐水组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05).各组缺血再灌注后脑梗死灶周围白质与皮质rCBF均较对侧稍减少:pAdCMV-HTK组治疗后12h,梗死灶周围白质与皮质rCBF较空白对照组与生理盐水组有增高.但不明显,差异无统计学意义(P>0.05),而在治疗24h、72 h后rCBF则明显增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在脑缺血再灌注后,Kallikrein基因转导可增加梗死灶周围脑组织的血管增生,改善rCBF,减小梗死面积,从而达到保护缺血神经细胞功能的作用.     

Persephin基因转染对缺氧诱导神经干细胞凋亡的影响

背景:如何抑制或减少神经干细胞凋亡的发生,促进缺氧后神经干细胞的存活,成为脑梗死神经干细胞移植治疗的研究热点。目地:观察在缺氧状态下转染人类persephin基因对神经干细胞凋亡的作用。设计:完全随机分组,对照实验。单位:中山大学附属第二医院神经内科。材料:实验于2006-07/2006-12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成,重组腺病毒pAd persephin由本实验室构建保存,C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。胰蛋白酶、DMEM/F12购自Gibco公司;胎牛血清来自杭州四季青生物工程公司;多聚赖氨酸购自美国Sigma公司;TUNEL检测试剂盒,阳离子脂质体FuGENE购自瑞士Roche公司;S-P免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福建迈新生物工程公司;鼠抗人Nestin单抗,Persephin兔抗人多抗购自美国Santa Crus公司,persephin反义寡核脱氧苷酸由上海生工合成。方法:①实验干预:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,分为4组,A组:正常对照组,C17.2神经干细胞不作缺氧处理。B组:缺氧处理组,即置于37℃、体积分数0.95N2,体积分数0.05CO2厌氧培养箱培养。C组:缺氧 pAdpersiphin转染组,即:将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,pAdpersiphin转染48h后的细胞置同B组条件的厌氧培养箱培养。D组:缺氧 pAdpersiphin转染组 persiphin反义寡核脱氧苷酸,即pAdpersiphin persiphin反义寡核脱氧苷酸转染。②实验评估:Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。主要观察指标:Persephin蛋白的表达、细胞凋亡指数和凋亡率。结果:①Persephin蛋白表达:C组细胞经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在,Mr约为24000,符合预期结果,说明persiphin成功表达,D组亦可见一Mr 24000的条带,但条带较单纯pAdpersiphin感染组明显为淡,说明反义persiphin反义寡核脱氧苷酸可成功抑制pAdCMVpersiphin的表达。②细胞凋亡指数:C组凋亡细胞明显减少,凋亡指数低于B、D组(P<0.01),但高于A组(P<0.01),表明细胞凋亡未完全避免。③细胞凋亡率:B、D组凋亡率明显高于A组(P<0.01),C组明显较B组、D组低(P<0.01)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

急性放射性脑损伤鼠模型的建立

背景：目前国内外关于放射性脑损伤动物模型的研究均处于探索中，尚未形成成熟的模型制作方法。目的：建立急性放射性脑损伤的鼠模型，为进一步研究放射性脑损伤正确有效的预防措施提供实验依据。设计：以实验动物为研究对象，随机对照观察研究。单位：一所大学医院动物实验室。材料：实验于2001-06／2002—08在中山大学附属第二医院实验室完成。SD大鼠60只，体质量(300&;#177;30)g，雌雄各半，空白对照组20只，实验组40只。方法：SD大鼠头部接受^60Coγ射线照射，7Gy／次，1次／d，连续照射6d，总剂量42Gy。照射结束后每日观察大鼠摄食、饮水量及次数，自主活动情况．有无出现神经系统症状与体征，每周检查并记录大鼠头部照射区毛发与皮肤情况、体质量变化，照射结束后第3，7，14，30天断头取脑，行病理组织学检查。主要观察指标：①一般情况观察。②照射后脑组织病理改变。结果：照射第3天起即出现每日摄食、饮水量减少；照射第1，2天，自主活动较对照组增多，第3天起活动渐减少；无异常神经系统体征；随观察时间延长体质量增长较对照组慢，但差异无显著性意义；所有大鼠均于照射后约2周时出现照射野轻度脱毛；照射后出现脑组织神经元变性坏死。结论：该模型制作方法切实、可靠，较好地模拟放射性脑损伤的过程，可用于预防或减轻放射治疗对脑组织损伤的实验研究。     

大鼠脑梗死后乏氧组织变化与血管增生的关系

目的： 探索脑梗死后乏氧组织的变化与血管增生的关系。方法：利用大鼠脑缺血1.5 h再灌注（1.5 h IR组）和持续缺血（PI组）的线栓模型,采用2-(2-硝基-1氢-硝基咪唑-1-羟基)-氮-（2,2,3,3,3-5氟嘌呤）乙酰唑胺（EF5）和血管性假性血友病因子 (vWF)免疫荧光方法观察乏氧组织和微血管密度（MVD）,比较2组术后3 d、7 d、14 d缺血侧大脑半球皮层的MVD以及与乏氧组织的关系。结果： 1.5 h IR组术后3 d、7 d、14 d均见乏氧组织存在,PI组乏氧组织仅存在3 d,假手术组不存在乏氧组织。各观察时点的乏氧组织内部MVD均较周围区域的MVD小（均P<0.01）。随着时间的延长,1.5 h IR组和PI组的皮层MVD均不断增大（均P<0.01）,而1.5 h IR组7 d和14 d的皮层MVD均高于PI组（均P<0.01）。结论： 脑梗死后乏氧组织出现在微血管稀疏的区域。微血管增生程度的差异是导致乏氧组织持续时间不同的原因之一。     

NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死

目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组。条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠。pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建。Dil18荧光染料(Chemicon公司产品)。②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂。各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1mm,旁开2mm,深度1.2mm;前囟尾侧3mm,旁开1.5mm,深度1.2mm;前囟尾侧6mm,旁开2mm,深度1.2mm。模型对照组每位点注射单纯培养液2μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞悬液2μL,余20只每位点移植pAdeasy-NURR1 C17.2神经干细胞悬液2μL。③实验评估:各组大鼠分别在移植前1d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分。移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测。移植后6个月行组织学检查。结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充。①神经功能缺损评分:移植前1d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P>0.05)。移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转基因神经干细胞组神经功能缺损评分均明显低于模型对照组(P<0.05);转基因神经干细胞组下降趋势较神经干细胞组更为显著(P<0.05)。②Dil18荧光细胞示踪结果:移植后1周荧光示踪细胞主要在针道内,少数细胞开始移行至周围神经组织。移植后2周,细胞移行至更远距离,并明显向梗死灶方向移行,细胞有突触样结构与周围细胞形成联系。移植后1个月细胞向周围扩散,甚至在远隔部位也可见荧光细胞。③神经元特异烯醇化酶免疫组化检测结果:移植后2周、1个月,转基因神经干细胞组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数均明显高于神经干细胞组(P均<0.05)。④细胞组织学检查:移植后6个月,各组大鼠注射针道周围脑组织仍呈正常的层次和结构,未见有明显异型细胞增生。结论:①NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗局灶性脑梗死能显著改善神经功能缺损,效果优于C17.2神经干细胞。②移植后供体细胞存活并向注射针道周围神经组织移行,促进神经干细胞向神经元方向的分化。     

脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区TLR9信号通路的活化

目的 观察大鼠脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区皮层Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)信号通路的活化情况.方法 制备Sprague-Dawley(SD)大鼠短暂大脑中动脉闭塞模型,缺血90 min后再灌注,随机分两组:6 h组(n=5)和3 d组(n=5),分别采用RT-PCR、Western-blot法测定梗死灶边缘区皮层TLR9、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)、干扰素-β(interferon-beta,IFN-β)的mRNA及蛋白表达.结果 6 h和3 d组TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表达量分别为(0.43±0.03)和(0.93±0.03)、(1.21 4±0.11)和(2.26±0.16)、(0.44±0.04)和(1.27±0.17)、(0.15±0.02)和(0.26±0.03),蛋白表达量分别为(0.75±0.04)和(1.35±0.04)、(0.93±0.04)和(1.05±0.02)、(0.54±0.03)和(0.73±0.02)、(0.82±0.02)和(0.93±0.03)(组间比较,均P<0.01).同组内TNF-α的表达明显高于IFN-β的表达(均P<0.01).结论 TLR9信号通路在脑梗死早期的炎症反应中可能起重要作用.     

肾性高血压大鼠脑梗死后期的基因表达谱分析

目的 利用基因芯片技术研究肾性高血压大鼠脑梗死后期梗死灶边缘区皮层基因表达谱的改变及其意义.方法 利用双肾双夹法复制肾性高血压大鼠模型,再采用线栓法复制成大脑中动脉闭塞模型,并设置假手术组,术后7 d取梗死灶边缘区域脑皮层,提取RNA,经过荧光标记后与含5705个基因的oligo芯片进行杂交、扫描,采集图像,经数据分析筛选出差异表达的基因.结果 差异表达基因共197个(包括表达序列标签12个),其中表达上调174个,下调23个.12类功能分组的基因均有上调,下调的基因仅包括运输、转录调控、信号、应激反应、代谢和细胞粘附组的基因.12类功能分组中有17个差异表达基因尚未有文献报道与脑缺血/梗死相关.结论 脑梗死后期基因表达仍然非常活跃,预示着损伤与修复的分子机制和可能的治疗靶点.