tdh+与tdh?副溶血弧菌耐药表型与基因型差异分析

  目的  描述tdh+与tdh?副溶血弧菌表型与基因型耐药差异,分析耐药基因型与耐药表型之间的关系。  方法  采用K-B纸片法检测208株tdh+与73株tdh?副溶血弧菌对临床及水产养殖中常用的7类16种抗生素的敏感性,使用新一代测序技术获得实验菌株的全基因序列,通过序列比对分析基因组中耐药基因及耐药相关基因突变情况。 分析耐药表型与基因型之间的关系。  结果  tdh+菌株和tdh?菌株对亚胺培南均100%敏感。 tdh+菌株对头孢吡肟、阿奇霉素耐药率（0.48%、8.65%）高于tdh?菌株（0.00%、4.11%）;tdh?菌株对氨苄西林、头孢西汀、头孢曲松、环丙沙星、萘啶酸、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑、复方新诺明、四环素、多西环素、氯霉素耐药率均高于tdh+菌株。 tdh?菌株的多重耐药率（34.25%）高于tdh+菌株（19.23%）。 耐药基因共检出5类7种,其中β-内酰胺类bla_CARB基因在所有的tdh+菌株和tdh?菌株均检出;四环素类tet（34）基因在tdh+与tdh?菌株基因携带率分别为99.52%、98.63%;喹诺酮类耐药基因qnrS5 仅在tdh+菌株中检出;tdh?菌株中叶酸代谢抑制类（sul2）、四环素类［tet（35）、tet（59）］、苯丙醇类（floR）耐药基因检出率高于tdh+菌株。 共在14株（tdh+9株,tdh?5株）细菌中检索出6种耐药基因点突变方式,均为编码16S rRNA的rrs基因突变。  结论  tdh?副溶血弧菌耐药现象较tdh+副溶血弧菌更为严重; 16S rRNA的rrs基因突变是除aph（3'）-Ib、aac（3）-Ⅱ、aac（6’） -I、aph（3'）-Id等耐药基因外副溶血弧菌对氨基糖胺类药物耐药的主要机制之一;副溶血弧菌中,可用bla_CARB耐药基因存在情况预测副溶血弧菌氨苄西林耐药表型;除此之外其余抗生素耐药表型与其对应耐药基因之间未见明确的对应的关系。     

血流感染O139群霍乱弧菌的耐药性及基因组特征分析

目的分析1株从菌血症患者血液中分离到的O139群霍乱弧菌产毒株的耐药性及基因组特征。方法使用肉汤稀释法和全自动药敏分析仪测定菌株的抗生素敏感性, 使用二代基因测序和纳米孔测序获得菌株的完整基因组序列, 使用BLAST在线比对与CARD、Resfinder、ISfinder、VFDB等数据库进行比对分析, 明确菌株携带的耐药基因、插入序列和毒力基因等, 使用MEGA 5.1软件构建基于核心基因组单核苷酸多态性的遗传系统发生树。结果霍乱弧菌SH400为O139群产霍乱毒素的菌株, 携带了多个毒力相关基因和4个毒力岛。该菌株对链霉素、四环素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药并携带了相应的耐药基因。该菌株携带了大小为172 914 bp并且含有10种耐药基因的IncA/C型质粒。结合基因组进化关系发现, 菌株间携带耐药基因和耐药质粒的情况呈现出一定聚集性。菌株SH400的传统ST型为ST69, cgMLST型为与cgST-252高度相似的新型别。结论该株O139群霍乱弧菌携带ctxAB毒力基因、多种耐药基因和IncA/C型质粒, 且存在多重耐药岛。     

基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩...     

基于基因组序列的3种沙门菌分子血清分型方法比较研究

  目的  比较3种沙门菌分子血清分型方法,获得一种准确度较高的方法用来替代传统的血清凝集技术用于沙门菌血清型判定。  方法  对覆盖50个血清型的509株沙门菌提取核酸进行全基因组测序,根据全基因组序列分别利用多位点序列分型（MLST）、SalmonSeroPredicition以及SISTR（Salmonella in silico typing resource）3种方法在线预测获得每株菌的血清型,然后与传统血清凝集获得的血清型进行一致性比较分析,评估每种方法血清型预测的准确度。  结果  SISTR、MLST以及SalmonSeroPredicition预测血清型的准确率分别为96.67%、93.52%、69.16%。 常见沙门菌血清型印第安纳沙门菌和鼠伤寒沙门菌血清型预测正确率最高,为100%,德尔卑沙门菌、肠炎沙门菌血清型预测正确率分别为99.17%、95.74%。 3种方法均预测错误的血清型有肠炎沙门菌、德尔卑沙门菌和沙门菌的萨拉姆亚种、亚利桑那亚种和双相亚利桑那亚种等;预测错误原因主要是基因序列丢失和鞭毛抗原基因未表达。  结论  基于基因组序列的SISTR血清型预测方法具有较高的血清型预测准确度,在传统血清凝集难以开展或沙门菌鞭毛基因不表达的情况下,可以替代血清凝集试验进行沙门菌血清型判定。     

霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株重组特征分析

目的分析霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株基因组的重组特征。方法在美国国立生物技术信息中心数据库中,选取分离时间从1937—2015年的292株霍乱弧菌O1血清群El Tor菌株完成图序列或草图序列,以菌株N16961的基因组序列为参照,使用snippy软件获得菌株的全基因组比对信息,利用ClonalFrameML软件对数据进行重组分析,比较大小染色体间重组数目及重组区域总长度的差异,以及不同分离地区菌株的基因组重组片段数目和总长度的差异。使用KOBAS分析工具对重组热点基因进行基因本体富集分析。结果292株霍乱弧菌菌株中,发生基因重组163株(55.8%);其中,归一化处理的小染色体重组片段数目M(P25,P75)为4.7×10^-(69.3×10^-7,2.0×10^-5),大于大染色体[2.4×10^-(63.4×10^-7,5.7×10^-6)](P<0.001);小染色体重组区域占小染色体长度的比例M(P25,P75)7.1%×10^-(53.7%×10^-6,4.8%×10^-4),大于大染色体[2.2%×10^-(52.4%×10^-6,8.4%×10^-5)](P<0.001)。分离自非洲、亚洲、欧洲、北美洲和南美洲的菌株重组片段数目M(P25,P75)分别为23(1.0,33.0)、1.0(0.0,34.0)、6.0(2.0,13.0)、0.0(0.0,1.0)和29.5(6.8,56.8)(P<0.001);分离自各大洲的菌株重组区域总长度M(P25,P75)分别为233.0(4.0,461.0)、11.0(0.0,695.5)、56.0(4.0,111.0)、0.0(0.0,9.0)和347.5(132.8,1323.5)bp(P<0.001)。富集分析结果显示,62个重组热点编码基因的功能主要集中在趋化、趋性、对外界刺激的反应、受体活性和分子转导活性。结论霍乱弧菌El Tor大小染色体的重组片段数目及区域长度存在差别,不同大洲菌株重组片段数目及重组区域总长度不同。     

有限稀释病人PBMCs共培养法分离培养HIV-1 CRF07_BC生物性克隆病毒

目的通过有限稀释艾滋病病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)与正常供体PBMCs共培养,分离培养HIV-1生物性克隆毒株。方法选择6位新疆HIV-1CRF07_BC感染者,分离病人PBMCs,以不同浓度的病人PBMCs细胞数梯度(推荐浓度分别为5×103、2×104、4×104/孔)与健康供体的1×105PBMCs共培养,每个浓度设置32个复孔,每周检测HIV p24抗原。当某一浓度的复孔中p24阳性率低于33%时,可认为在这些阳性孔中的病毒是起源于同一个感染细胞。同时进行env区V1-V5基因扩增、测序和分析。结果经过有限稀释法共培养后,样本XJZK007在1×104细胞/孔的浓度下,各复孔HIV-1p24阳性率为31.3%;样本CBJB539在4×104细胞/孔的浓度下,得到9.4%分离阳性率;样本CBJB540在2×104细胞/孔的浓度下,得到25%分离阳性率;样本CBJB541在2×104细胞/孔的浓度下,得到12.5%分离阳性率;样本CBJB543在1×104细胞/孔的浓度下,得到21.9%分离阳性率;样本CBJB544在2×104细胞/孔的浓度下,得到25%分离阳性率。同一样本分离的不同生物克隆表现出不同的生物表型。对样本XJZK007分离得到的12株生物克隆的序列分析显示,各序列相互之间存在氨基酸的变异、插入及缺失,从而验证了生物性克隆方法的正确性与可行性。结论有限稀释病人PBMCs共培养方法,以常规分离方法十分之一的细胞数即可分离得到个体内多样性的病毒,即生物克隆病毒。     

霍乱弧菌O1血清群产毒株重复基因分析

目的对霍乱弧菌O1血清群产毒株基因组中重复基因数量分布、多样性及两种生物型中重复基因的差异进行分析。方法选择300株引起第6次和第7次大流行的O1群古典型和埃尔托型生物型菌株，使用BLAST和MCL等软件分析重复基因数量分布及两种生物型差异的重复基因；使用序列两两平均距离作为多样性的度量方法分析重复基因的遗传多样性以及在两种生物型之间存在遗传多样性差异的重复基因。结果每株菌平均包含242.63个同源基因簇，其中每株埃尔托型和古典型菌株分别平均包含244.85和209.74个。 筛选到13个在埃尔托生物型与古典生物型之间拷贝数存在显著差异同源基因簇，功能主要包括阴离子、氨基酸等物质的转运、定位、跨膜转运等。 对存在重复基因的同源基因簇的遗传多样性分析，发现在两种生物型之间多样性存在差异的同源基因簇50个，这些基因簇的功能主要包括阴离子、氨基酸、有机底物等转运、定植、底物特异的跨膜转运活性等。结论霍乱弧菌重复基因的进化有一定的功能倾向性，其特征解析对于理解其基因组适应性进化、菌株多样性及两种生物型基因组差异进化提供了新依据。     

dapb1基因对诺卡菌系统分类和物种鉴定方法的建立与评价

目的 评价dapb1基因对诺卡菌属系统分类和物种鉴定的能力.方法 从公共数据库中获得230株菌株(198株诺卡菌属菌株和32株非诺卡菌属菌株)基因组序列,从198株诺卡菌(90株模式菌株、31株标准菌株和77株临床菌株)基因组中提取dapb1基因,采用clustalo进行多序列比对,并用iqtree构建系统发育树.计算...     

城市对海口市南渡江的微生物群落及其毒力因子与抗生素耐药基因组的影响

目的探讨河流流经海口市前后河水中细菌菌群结构、抗生素耐药基因组和病原菌毒力基因组的变化, 及其传播扩散模式。方法从流经海口市前的南渡江上游至南渡江入海口划分前、中、后段3个研究区域, 每个区域选择3个采样点, 每个采样点平行采集6份样本并混合为1份, 每份3 L。通过宏基因组测序和16S rRNA基因全长测序获得相关生物信息数据, 分析前、中、后3段水体中微生物群落结构以及耐药基因、毒力因子和可移动遗传元件信息。运用主坐标分析、普氏分析和曼特尔检测等方法分析样本间菌群分布差异以及传播模式相关性。结果随着河水流经海口市, 微生物的α多样性呈现逐渐降低趋势。其中变形菌门在前、中、后段的细菌群落中均占据主导地位, 中、后段变形菌门相对丰度高于前段。抗生素耐药基因、毒力因子及可移动遗传元件的多样性和丰度在前段均处于较低水平, 流经海口市后, 均明显升高。同时, 可移动遗传元件介导的水平传播在抗生素耐药基因和毒力因子扩散中发挥较大作用。结论城市化对河流中的微生物及其携带的耐药基因、毒力因子和可移动遗传元件产生显著影响。在海口市南渡江, 河流流经城市受纳了人群排出的抗生素耐药菌和病原相关细菌, 同...     

宏基因组测序在腹泻暴发调查中的应用

  目的  评价宏基因组测序技术在腹泻暴发中的潜在应用价值。  方法  收集2017年报告的2例聚集性腹泻暴发事件的样品,针对样品进行多重荧光PCR检测;同时,应用宏基因组测序技术对样品进行测序,基于测序数据分析暴发事件的病原体。  结果  案例1采用多重荧光PCR检测,仅检测到副溶血弧菌;而采用宏基因组测序技术除检测到副溶血弧菌外,还检测到更高丰度的沙门菌。案例2采用多重荧光PCR未检测到病原体的样品,采用宏基因组测序技术检测到了志贺菌。  结论  宏基因组测序不需先验知识进行预判,可以避免引入误判,更有利于发现混合感染,而且在保证足够测序深度的情况下,可以获得比荧光PCR法更高的检测灵敏度。