HL－60细胞诱导分化后血管内皮生长因子表达变化分子机制的探讨

目的探讨全反式维甲酸（ATRA）诱导HL-60细胞分化模型中血管内皮生长因子（VEGF）表达调控的分子机制,为白血病的抗血管新生治疗提供新的靶点。方法Wright—Gimesa染色观察细胞形态,硝基四唑氮蓝（NBT）还原实验检测HL-60细胞分化,逆转录－聚合酶链反应（RT—PCR）、蛋白质印记（Westernblot）分别从mRNA和蛋白水平检测细胞VEGF、信号转导和转录激活因子-3（STA33）、c-myc的表达变化。结果1μmolATRA作用于HL-60细胞96h后可明显抑制细胞增殖,并出现明显的分化现象,倒置显微镜下可观察到细胞向成熟粒细胞方向分化;NBT阳性率为82．59％（t=－24．157,P〈0．01）;VEGFmRNA表达水平下降（t=7．339,P〈0．05）、STAT3mRNA表达水平下降（t=3．667,P〈0．05）、c—mycmRNA表达水平下降（t=6．858,P〈0．05）。VEGF蛋白表达水平下降（t=3．386,P〈0．05）、STA33蛋白表达水平下降（t=4．074,P〈0．05）、c-myc蛋白表达水平下降（t=3．333,P〈0．05）。结论在ATRA诱导HL-60细胞分化的模型中VEGF的表达水平随诱导分化的进程而下降,其下调机制可能与STAT3、c—myc具有相关性。     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

PADI4基因与白血病细胞分化关系的实验研究

目的体外探讨PADI4基因与白血病细胞分化的关系。方法检测HL60、K562、U937等9株不同白血病细胞株中PADI4在mRNA水平的表达情况,建立ATRA诱导HL60细胞分化模型,然后分别利用RT-PCR及WB技术检测PADI4基因在转录和翻译水平的表达变化。结果不同类型的白血病细胞株中PADI4表达情况不同。ATRA诱导HL60细胞后,在药物作用的96h内,随着药物作用时间的增加,在转录和翻译水平PADI4表达水平逐渐下调,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.01)。结论 PADI4与白血病细胞的分化有关,ATRA诱导HL60细胞分化后PADI4表达下调。     

葫芦素B抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖机制的初步研究

目的研究葫芦素B对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响及其作用的分子机制。方法通过MTT法检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞增殖的影响,流式细胞仪检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞凋亡和生理水平上活性氧含量、线粒体膜电位的影响。Hoechst 33258染色检测药物处理前后细胞形态的变化。Westernblot检测葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h前后Bcl-2、Bax、p21、p53等蛋白合成的变化。结果实验浓度范围内,葫芦素B可时间与浓度依赖性地抑制SH-SY5Y细胞增殖;浓度依赖性地诱导SH-SY5Y细胞凋亡、活性氧水平升高和线粒体膜去极化;在蛋白水平上,葫芦素B能诱导凋亡抑制蛋白Bcl-2下调,促凋亡蛋白Bax、p21、p53上调。结论葫芦素B在体外能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,这一影响可能通过诱导细胞凋亡、ROS积累、线粒体膜去极化及其相关蛋白表达变化来实现。     

天然免疫分子LILRB5慢病毒稳定转染THP-1细胞系的构建

目的构建天然免疫分子LILRB5的慢病毒表达载体,获得稳定转染LILRB5的单核细胞系。方法将LILRB5构建入真核表达载体pEGFP-flag,瞬时转染293T细胞系,通过免疫荧光和流式细胞术检测LILRB5-GFP和LILRB5-flag在293T细胞中的表达。构建慢病毒表达载体pHR-LILRB5,与p8.91和pMD共同转入293T细胞,产生标记有绿色荧光的LILRB5慢病毒,感染单核细胞系THP-1后通过流式细胞术检测LILRB5的表达。结果测序显示真核表达载体pEGFP-LILRB5-flag的序列与预期相符,瞬时转染pEGFP-LILRB5-flag的293T细胞可检测到绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测显示LILRB5-flag在细胞膜表面有表达;构建亚克隆慢病毒载体pHR-LILRB5,经测序验证后,转染293T细胞,产生LILRB5的慢病毒,并感染THP-1细胞,流式细胞术检测LILRB5在THP-1细胞稳定表达。结论构建LILRB5的慢病毒载体,通过LILRB5慢病毒感染建立LILRB5的稳转THP-1细胞系。     

TRIM22靶向调控eIF4E在NB4细胞粒系定向分化过程中的作用与机制

目的 探讨在人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞粒系分化过程中三基序蛋白22(TRIM22)的功能及其与真核细胞起始因子4E(eIF4E)的相互作用,从而进一步阐明TRIM22靶向调控eIF4E的机制.方法 体外实验建立NB4细胞诱导分化模型,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western blotting技术检测TRIM22、eIF4E基因和蛋白表达的变化,并通过电穿孔转染技术敲低或过表达TRIM22后利用CCK-8和流式细胞术检测其对细胞功能的影响,及对eIF4E蛋白表达水平的影响,最后利用免疫共沉淀(CO-IP)实验验证TRIM22与eIF4E的相互作用.结果 全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞后,TRIM22的mRNA相对表达量由1.01±0.15逐渐升高到30.98±2.79(F=280.700,P=0.000),蛋白相对表达水平由0.22±0.03逐渐升高至0.51±0.05(F=51.430,P=0.000).反之,eIF4E的mRNA相对表达量由1.01±0.09逐渐降低至0.47±0.06(F=20.520,P=0.000),蛋白相对表达水平由0.97±0.02逐渐降低至0.64±0.09(F=14.700,P=0.001).流式细胞术检测TRIM22过表达后ATRA干预组PE-CD11b表达水平[(78.80±2.00)%]比空载体ATRA干预组[(58.70±2.70)%]和共转染后ATRA干预组[(61.60±3.80)%]均升高(t=9.535,P=0.000;t=8.187,P=0.000).同时,过表达TRIM22基因水平后,eIF4E蛋白水平会反向变化(t=4.985,P=0.007).CO-IP实验验证TRIM22通过结合eIF4E而起作用.结论 TRIM22在NB4细胞粒系定向分化过程中促进细胞分化,并且可通过靶向结合eIF4E抑制其表达而发挥重要作用.     

胰腺癌组织Six1表达及其临床意义的研究

目的:研究Six1在胰腺癌组织及胰腺炎、良性腺瘤和癌旁组织中的表达情况,探讨Six1与胰腺癌的关系及其临床生物学意义.方法:采用蛋白质印迹法及免疫组织化学技术,检测Six1在4株胰腺癌细胞系及3T3细胞系的表达和其在胰腺癌、良性腺瘤、胰腺炎及癌旁组织中的表达.结果:蛋白质印迹法结果显示,Six1在Bxpc-3和CFPAC-1细胞株中的表达明显增强;并且在胰腺癌组织和良性腺瘤组织的表达也显著高于癌旁组织.免疫组化结果显示,34例(85.0%)胰腺癌组织、3例(75.0%)良性腺瘤组织、6例(60.0%)胰腺炎和癌旁组织中Six1表达阳性;其阳性表达与肿瘤大小和远处转移显著相关(P＜0.05).结论:Six1表达是胰腺癌发生的早期事件,可能导致肿瘤向恶性发展;其表达水平与肿瘤大小及远处转移有关.     

全反式维甲酸诱导HL60细胞分化分子机制探讨

目的 探讨全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA)诱导HL-60细胞分化过程中PADI4的变化与作用机制.方法 ATRA诱导HL-60细胞24、48、72和96 h后,采用Wright-Gimesa染色观察细胞形态学变化;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达变化;采用RT-PCR分析PADI4在基因水平的表达趋势,蛋白质印迹法检测PADI4在蛋白水平的表达变化;RNAi技术干扰PADI4后流式细胞仪检测CD11b变化,蛋白质印迹法检测PADI4、p42/44、p65、p105和p55等蛋白水平变化.结果 HL-60细胞经ATRA诱导后与对照组相比,Wright-Gimesa染色显示核质比明显减小,核有凹陷及分叶,杆状核、分叶核现象明显增多.流式细胞术检测结果显示,细胞表面分子CD11b表达由2.1％升高到48.9％,升高了346.8％,t=411.51,P＜0.01;RT-PCR结果显示,PADI4在mRNA水平表达随时间延长逐渐升高,F＝ 318.046,P＜0.001,r=0.595;PADI4与内参基因GAPDH灰度值的比值从0.122±0.033升高到0.464±0.077,差异有统计学意义,F＝16.002,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,PADI4在蛋白水平表达随时间延长逐渐升高,F=16.002,P＜0.001,r=0.873;PADI4与内参GAPDH灰度值的比值分析从0.077±0.045升高到0.263±0.095,差异有统计学意义,F＝221.8,P＜0.000 1.蛋白质印迹法检测结果显示,P-p44/42与内参GAPDH灰度值的比值分析从0.470±0.023下降到0.320±0.012,差异有统计学意义,F=92.942,P＜0.001.结论 ATRA诱导HL-60细胞定向粒系分化的过程中,PADI4促进HL-60细胞向粒系分化,而且PADI4可能是通过促进MAPK信号通路中的p42/44磷酸化而发挥作用.     

全反式维甲酸联合丙戊酸钠诱导白血病细胞分化过程中BRD4表达变化及其作用的研究

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)联合丙戊酸钠(VPA)诱导HL-60细胞分化过程中BRD4表达调控的分子机制。方法建立ATRA联合VPA诱导白血病细胞株HL-60的分化模型,瑞氏-吉姆萨(Wright-Gimesa)染色观察HL-60细胞形态,流式细胞术检测细胞表面分化抗原的表达,蛋白质印记从蛋白水平检测HL-60细胞经药物诱导24、48、72h后BRD4表达的变化。结果单独应用ATRA或VPA均能够明显抑制白血病细胞生长,诱导细胞分化,倒置显微镜下可观察到HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化,细胞表面的分化抗原表达升高,联合诱导分化模型中细胞表面分化抗原表达升高更明显,两者均有统计学意义,在蛋白水平BRD4的表达逐渐降低,联合诱导分化模型中降低更明显,两者有统计学意义。结论 VPA可以明显的促进ATRA诱导白血病细胞的分化作用,BRD4基因的表达在随着分化程度的加强出现逐渐降低的趋势。     

Ezrin的原核表达及与其相互作用蛋白的研究

目的体外筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。方法提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒转化E．coli DH5α,获得pET15b-Ezrin重组质粒,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E．coliB L21-CodonPlus（DE3）-RIL,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达产物进行Ni^2＋-NTA亲和层析和分子筛纯化后,行SDS-PAGE、MALDI—TOF—MS／MS质谱分析和蛋白质印迹鉴定。裂解Panc-1细胞,获得总蛋白提取液,采用Pull—down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白,并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI—TOF—MS／MS质谱鉴定。结果RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段（1761bp）与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS—PAGE、质谱分析和蛋白质印迹分析显示纯化后Ezrin重组蛋白相对分子质量为69400,与质谱分析的相对分子质量结果相符,为带有His-6标签的特异蛋白。双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的7种蛋白,其分别为RNA—binding motif protein39（RBM39）、Transgelin（TAGLN）、Albumin（ALBU）、Formin—1（FMN1）、Rho GTPases（RHGBA）、Tetratricopeptide repeat protein 16（TTC16）、Syntaxin—binding protein 1（STXBPI）。结论在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白,并在体外成功筛选出可信的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。