谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。     

两种分泌型人谷氨酸脱羧酶65片段DNA疫苗的构建与鉴定

目的:构建和鉴定分泌型人谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)65片段DNA疫苗.方法:从人GAD65质粒中扩增出GAD190-315和GAD490-570两个片段的cDNA,分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的片段克隆入pBudCE4.1真核表达载体,测序鉴定,并用Western印迹检测融合基因的表达.结果:核酸序列测定表明克隆的融合基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western印迹检测显示这两种人GAD65片段分泌表达.结论:两种分泌型人GAD65片段DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防提供了实验基础.     

敲降Ras相关结合蛋白23表达对食管鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移的影响及机制

目的探讨Ras相关结合蛋白23(RAB23)在食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)细胞侵袭和迁移中的作用和机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测16例配对食管鳞癌及癌旁正常组织中RAB23 mRNA的表达。比较基因表达综合(GEO)数据库的GSE20347数据集中食管鳞癌和配对癌旁正常组织RAB23 mRNA的表达水平。免疫组织化学检测106例配对食管鳞癌和癌旁正常组织、33例淋巴结阳性与10例淋巴结阴性患者原发灶与淋巴结组织中RAB23蛋白含量。在食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞中瞬时敲降RAB23表达(转染si-RAB23-1和si-RAB23-9)或者稳定敲降RAB23表达(转染sh-RAB23), 采用Western blot法验证RAB23敲降效率, 采用细胞计数试剂盒8法和裸鼠皮下成瘤实验检测食管鳞癌细胞的增殖能力, 采用Transwell实验和裸鼠尾静脉-肺转移实验检测食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力, 采用细胞黏附实验检测食管鳞癌细胞的黏附能力, 采用转录组测序技术分析RAB23敲降后对细胞转录谱的影响, 并通过Western blot检测验证相关信号通路。结果 16...     

化疗药物对肺癌患者血清肿瘤坏死因子的影响

目的 :研究肺癌患者血清肿瘤坏死因子 (TNF)水平及化疗药物对其的影响。方法 :分别测定肺癌患者及正常健康人血清TNF水平 ,应用化疗药物 (卡铂、足叶乙甙 )治疗 ,于化疗结束后 1周、2周测定肺癌患者血清TNF水平。结果 :肺癌患者血清TNF水平与正常健康人比较差异无显著性 ,应用化疗药物后 1周内血清TNF显著升高 ,然后逐渐下降 ,于化疗结束后 2周时又降至化疗前水平。结论 :化疗后血清TNF水平升高 ,直接杀伤肿瘤细胞。     

非小细胞肺癌组织粒细胞集落刺激因子受体的表达

目的:研究粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达。方法:免疫组化SP法、蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测48例NSCLC组织及癌旁组织中G-CSFR蛋白及G-CSFRmRNA的表达。结果:免疫组化及蛋白质印迹法均表明,NSCLC组织G-CSFR蛋白表达高于正常组织(P=0.019,P<0.01),且在不同分化级别的NSCLC组织中,G-CSFR蛋白表达强度差异有统计学意义,P均<0.01。蛋白质印迹法检测亦显示,不同临床分期的NSCLC组织G-CSFR蛋白相对水平差异有统计学意义,P<0.01。RT-PCR检测显示,G-CSFR mRNA在NSCLC组织中的相对水平显著高于正常肺组织(P<0.01),且不同分化级别、临床分期的NSCLC组织G-CS-FR mRNA相对水平差异有统计学意义,P=0.027,P<0.01。结论:G-CSFR在NSCLC组织中的表达高于正常组织,且在分化级别较低、临床分期较晚的NSCLC组织中其表达水平更高。     

两种GAD65片段与IL-4基因共表达DNA疫苗的构建与鉴定

目的构建两种谷氨酸脱羧酶（GAD）65片段与白细胞介素4（IL-4）基因共表达DNA疫苗,并在体外COS-7细胞中对表达产物进行检测。方法从GAD65质粒中扩增出GAD190～315和GAD490～570两个片段的cDNA,Overlap法分别与hIL-2信号肽cDNA基因拼接,将拼接后的融合基因与IL-4基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中。重组子经酶切和测序鉴定后,脂质体转染COS-7细胞,Western blot法检测融合基因的表达,ELISA法检测IL-4表达。结果核酸序列测定表明克隆的融合基因和IL-4基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot和ELISA显示在COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。结论两种GAD65片段与IL-4共表达DNA疫苗均成功构建,为1型糖尿病的预防研究提供了实验基础。     

吡格列酮对NOD鼠糖尿病的预防作用及其机制探讨

目的探讨吡格列酮（PIO）对NOD鼠糖尿病发病率和胰岛炎的影响及其作用机制。方法4周龄NOD雌鼠随机分为2组，分别摄食0．02％PIO混合饲料（PIO，n=26）和普通饲料（对照组，n=25），观察30周龄时的糖尿病累积发病率。各组另取12周龄未患病NOD鼠（n=15）胰腺H～E染色观察胰岛炎；ELISA法测血清、脾细胞培养上清干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素4（IL～4）水平；RT-PCR检测脾脏IL-4、IFN～γmRNA的表达水平。结果30周龄时，PIO组发病率较对照组明显降低（P〈0．05）。12周龄时，PIO组胰岛炎平均积分低于对照组（P〈0．05）；血清、脾上清IL～4水平，脾脏IL-4mRNA表达水平显著性高于对照组（P〈0．05）；PIO血清、脾上清IL-4／IFN-γ比值水平高于对照组（P〈0．05）。结论PIO通过上调IL～4水平，促使免疫平衡向Th2方向偏移，从而使NOD鼠胰岛炎减轻，而在一定程度上预防和延缓NOD鼠糖尿病的发生。     

肝细胞癌发生的分子机理

肝细胞癌(HCC)的发生常常存在p53,m6p/IGF2R,P16INK4A,RB,APC等一系列基因突变.它们所作用的四种生长调节途径分别为①p53介导的DNA损害修复途径;②RB介导的细胞周期控制途径;③TGF-β介导的凋亡和抑制增殖途径;④β-CATENIN/APC介导的信号转导途径.     

环状RNA与冠心病的相关性研究

目的研究新的环状RNA hsacirc0009590、hsacirc0003302、hsacirc0023903与冠心病(CHD)的相关性以及hsacirc0043813基因的单核苷酸多态性位点(SNP)位点rs2293152与心梗风险的相关性。方法提取14例冠心病患者及14例对照组的外周血RNA,采用实时荧光定量PCR检测hsacirc0009590、hsacirc0029303及hsacirc0003302在冠心病及对照人群中的表达差异。提取450例冠心病患者的外周血DNA,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测SNP位点rs2293152与冠心病患者的心梗风险的相关性。结果与对照组相比,冠心病患者的hsacirc0009590、hsacirc0003302、hsacirc0029303表达水平均无显著差异(P>0.05),且与血糖、血脂等冠心病危险因素也无明显相关性(P>0.05);而rs2293152与冠心病患者的心梗发生风险无明显相关性(P>0.05)。结论hsacirc0009590、hsacirc0029303、hsacirc0003302与冠心病的患病风险可能无关,SNP位点rs2293152与冠心病的心梗风险可能无关。