候选抑癌基因ING4的研究进展

ING4基因是近年来发现的一个ING(生长抑制因子家族)新成员,可能通过抑制细胞生长,增强其化学敏感性、增强P53的活性、抑制HIF活性、抑制肿瘤血管增生等途径抑制肿瘤的生长.ING4基因在正常组织中表达丰富,而在肿瘤组织中表达异常与发生突变,但其在肿瘤发生、发展过程中的确切作用尚不清楚.     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3．0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）。目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF（Ad—VEGF165）转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11／2008—04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法：将Ad—VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降（P〈0．05）。再生丝素膜组Ad—VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高（P〈0．05），而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。     

Ad-hLIF转基因饲养层细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

目的 用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因(Ad-hLIF)感染WI-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/柑细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果.方法 用RT-PCR和ELISA法鉴定Ad-hLIF转基因饲养层细胞目的 基因的表达后,将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34+细胞在饲养层和/或细胞因子培养体系中扩增28 d,检测不同时间点的单个核细胞(MNC)数量及CD34+细胞阳性率;扩增后的MNC经CFDA SE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,RT-PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的门巢情况.结果 感染50MOI(multiplicity of infection)Ad-hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR和ELISA法结果 显示hLIF目的 基因能在WI-38饲养层细胞中表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.60%±2.58%,MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增,最高可达356.95±0.87倍,其中CD34+细胞仪在0～14 d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低.将其移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法搭定后.还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞.结论 成功建立的Ad-hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能.     

Ad-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达

目的 构建poly(A)-Promoter介导的携带人肿瘤生长抑制因子4(ING4)和人白细胞介素-24(IL-24)双基因的重组腺病毒共表达载体Ad-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24(简称Ad-ING4-IL-24),研究Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长的影响.方法 以含有poly(A)和Promoter (hEF1-eIF4g)基因片段的pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR扩增poly(A)-Promoter目的 片段(含Sal Ⅰ,Not Ⅰ),亚克隆至pAdTrack-CMV载体中以构建pAdTrack-CMV-poly(A)-Promoter空载体,再分别以pcDNA3.0-ING4和pcDNA3.0-IL-24重组质粒为模板,PCR扩增ING4(含BglⅡ,Sal Ⅰ)和IL-24(含XhoⅠ,XbaⅠ)目的 基因片段,并依次插入pAdTrack-CMV-poly(A)-Promoter载体中构建pAdTrackCMV-ING4-Poly(A)-Promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体,测序正确后用Pme Ⅰ酶线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24,再经Pac Ⅰ酶线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,经多轮扩增后收获Ad-ING4-IL-24重组腺病毒子,其效价可达3.5×109PFU/ml,用RT-PCR和Western blot法分别鉴定ING,4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中的转录和表达,MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长抑制和诱导细胞凋亡的功能及其增效作用.结果 DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、poly(A)-Promoter和IL-24序列与GenBank报道的完全一致,RT-PCR和Western blot检测结果显示Ad-ING4-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中表达;并能明显抑制HepG-2人肝癌细胞的生长和诱导其凋亡,其中Ad-ING4-IL-24双基因组更优于相应各单基因组.结论 成功构建了poly(A)-Promoter介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制HepG-2人肝癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用.     

北京市房山区儿童恶性肿瘤发病率和死亡回顾性调查

为掌握近几年儿童恶性肿瘤的流行情况,现将我区1993～1997年儿童恶性肿瘤的发病和病死情况做一回顾性调查分析,现报告如下。一、材料及方法1.调查对象:房山区有常住户口的1993～1997年0～14岁的儿童。病例来源为1993～1997年5年0～14岁新发儿童恶性肿瘤的病例。2.调查方法:1998年1月～12月底采用整群抽样的方法对房山区24个乡、一个工业区1993～1997年新发儿童恶性肿瘤的情况进行回顾性调查,由各级政府、乡卫生院、计划生育、儿保、防保人员协助完成。所有病例填写问卷式调查表,对儿童因患肿瘤死亡病例严格核实查对,同时对患恶性肿瘤的病例…     

CD34~＋造血干/祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究

目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用,并研究移植辐射损伤模型SCID小鼠的效果.方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果,建立辐射损伤模型SCID小鼠,将扩增后的CD34+造血干/祖细胞经CFDA SE荧光标记后移植入SCID小鼠体内,通过RT-PCR和观察荧光标记细胞来检测小鼠内的人源细胞.结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞纯度可达(95.6±2.58)%,与饲养层细胞共培养后CD34+造血干/祖细胞可扩增13.2倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,移植入SCID小鼠四周后,仍可见带有荧光标记的人源细胞,RT-PCR证明人源基因Alu的存在.结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且有较高的移植效率和造血活性.     

腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用

目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用.方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞巾的Bax、Bcl-2基闪表达的影响.结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡.结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的.     

腺病毒介导的ING4对裸鼠人骨肉瘤移植瘤的生长抑制作用

目的:研究腺病毒介导的人ING4基因(Ad-ING4)对MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤的生长抑制作用及其机制.方法:将本室构建好的重组腺病毒表达载体Ad-ING4,经QBI-293A细胞感染多轮扩增后获得高效价重组病毒子以用于肿瘤基因治疗试验,首先建立MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠模型,然后将15只荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(PBS组)、空载体对照组(Ad-GFP组)、Ad-ING4实验组(Ad-ING4组),3组均使用瘤体内注射干预用药,隔日一次,共5次.分别于用药前和用药后测量皮下瘤的体积,治疗开始后的第15天将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算抑瘤率.HE染色观察移植瘤细胞形态,免疫组化法检测瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34细胞因子的表达.结果:获得了高滴度(10~9pfu/ml)的重组腺病毒Ad-ING4;经瘤体基因治疗后,Ad-ING4组与PBS组及Ad-GFP组相比,可以明显抑制裸鼠MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤生长,瘤重抑制率可达59.3%,移植瘤组织中可出现典型的细胞凋亡、坏死现象,其分子机制可能与Ad-ING4明显上调瘤体中促进凋亡的细胞因子Bax、Caspase-3的表达,下调抑制凋亡因子Bcl-2及血管形成细胞因子VEGF、CD34的表达有关.结论:Ad-ING4可以显著抑制MG-63人骨肉瘤细胞荷瘤生长,其机制可能通过激活细胞凋亡和抑制血管形成等途径来发挥抑瘤作用.     

Ad-VEGF165转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

目的研究经腺病毒介导的人血管内皮生长因子165（VEGF165）转基因细胞修饰的再生丝素膜（SF）诱导血管形成活性及其分子机制。方法将WI-38人胚肺成纤维细胞分别培养在有（SFC组）或无（PBS组）再生丝素膜的24孔培养板上,24h后用带绿色荧光蛋白（GFP）基因的空载体腺病毒Ad-GFP（Ad-GFP组/SFCG组）或含有VEGF165目的基因的重组腺病毒Ad-VEGF165（Ad-VEGF165组/SFCV组）感染培养细胞。通过形态学观察和ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF165目的基因表达及其对细胞自分泌的血管生成素-1（Ang-1）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、血小板衍化生长因子（PDGF）表达的影响,并用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和在兔眼角膜上进行新生血管诱导实验。结果形态学观察发现WI-38细胞在再生丝素膜上不仅贴壁生长良好,而且易被Ad-GFP、Ad-VEGF165腺病毒感染,呈现强荧光。再生丝素膜利于Ad-VEGF165组中VEGF165目的基因在细胞中的高表达（P〈0.05）,而且还可使细胞自分泌的Ang-1表达水平明显升高（P〈0.05）,同时可维持细胞自分泌的FGF2及PDGF稳定表达。Ad-VEGF165组（SFCV组）具有促进CAM上血管生长活性和诱导兔眼角膜组织新生血管生成作用。结论 Ad-VEGF165感染WI-38成纤维细胞所修饰的再生丝素膜,具有诱导血管新生的功能。