国内110株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析

目的 对国内部分地区的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)临床株进行分子流行病学调查,分析其变种、基因型和交配型的构成和分布.方法 (1)PCR指纹分型法:以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR扩增,将所有受试菌株鉴定到8种主要基因型水平.(2)利用变种和交配型特异性引物扩增分型法,区分格鲁比变种(C.neoformans var.grubii)、新生变种(C.neoformans var.neoformans)和格特变种(C.neoformans var.gattii),同时鉴定α和a交配型.结果 110株临床株中,98株(89.1%)为格鲁比变种,均为VNI基因型和α交配型;9株(8.2%)格特变种,包括VGⅠ基因型、α交配型8株(7.3%)和VGⅡ基因型、α交配型1株(0.9%);2株(1.8%)为AD杂合体,VNⅢ基因型,-/α和α/-交配型各1株;1株(0.9%)为新生变种,VNⅣ基因型和a交配型.结论 我国新生隐球菌临床株包含3个变种和AD杂合体.与国外情况比较,相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株,且格鲁比变种中的VNⅠ基因型占了其中的大部分;但未发现VNⅡ、VGⅢ和VGⅣ基因型菌株.     

外用两性霉素B脂质体治愈茄病镰刀菌所致角膜炎一例报道

真菌性角膜炎是一种少见但严重的感染性角膜病变,具有很高的致盲率,近年来发病率呈上升趋势.镰刀菌属是引起角膜真菌感染常见的致病菌之一.在我国,真菌性角膜炎绝大多数由镰刀菌属所致,其中茄病镰刀菌是最常分离到的致病菌[1].本文报道1例经局部外用两性霉素B脂质体治愈的茄病镰刀菌致真菌性角膜炎的病例.     

外用两性霉素B脂质体治愈茄病镰刀菌所致角膜炎一例报道

真菌性角膜炎是一种少见但严重的感染性角膜病变,具有很高的致盲率,近年来发病率呈上升趋势.镰刀菌属是引起角膜真菌感染常见的致病菌之一.在我国,真菌性角膜炎绝大多数由镰刀菌属所致,其中茄病镰刀菌是最常分离到的致病菌[1].本文报道1例经局部外用两性霉素B脂质体治愈的茄病镰刀菌致真菌性角膜炎的病例.     

格特隐球菌vgⅡ基因型的快速鉴定和序列分型研究

目的 建立一种核糖体基因内间隔区(igs)的特异性pcr扩增和序列分析方法,用于快速鉴定格特隐球菌vgⅡ基因型及其亚型.方法 选取新型和格特隐球菌核糖体igs区中可变度最高的1区为靶点,经clustalx 2多重比对后,设计特异性扩增格特隐球菌vgⅡ基因型的引物用于pcr分析.通过扩增新型和格特隐球菌其余基因型以及其他致病酵母菌来评价引物的特异性,并对阳性扩增片段(vgⅡ基因型)进行测序和序列分型研究.结果 基于核糖体igs区的特异pcr引物扩增所有受试格特隐球菌vgⅡ基因型菌株均为阳性,而新型和格特隐球菌其余基因型以及其他致病酵母菌均为阴性.序列分型显示,在扩增片段的72、79和104 bp处存在3个多态性位点,可用于区分vgⅡ基因型中的不同亚型.结论 该研究建立的特异性pcr扩增方法可快速、准确地鉴定格特隐球菌vgⅡ基因型,对扩增片段的序列分型可初步筛查高致病性的vgⅡa亚型. abstract： objective to establish a pcr method for rapid identification and sequence typing of vg Ⅱ allele of the intergenic spacer region (igs) of cryptococcus gattii.methods since igs1 was of high sequence variation,multiple alignments were conducted by clustalx 2 in igs1 of cryptococcus gattii and cryptococcus neoformans,and then primer sets specific to genotype vg Ⅱ was designed for pcr analysis.the specificity of the primer pair was detected by amplification of the other genotypes in cryptococcus gattii,cryptococcus neoformans,and other pathogenic yeasts.the amplified fragments from vg Ⅱ genotype were sequenced and subtyped.results using the pcr analysis developed in this study,all vg Ⅱ genotype strains tested were amplified,whereas no amplification was obtained from other genotypes or yeast species involved herein.three polymorphic nucleotide sites at 72,79 and 104 bp in the fragment amplified could be used to distinguish sub-genotypes within vg Ⅱ genotype.conclusions the pcr analysis developed in this study can be used for rapid identification of genotype vg Ⅱ of cryptococcus gattii.the sequence typing based on the amplified fragment from igs1 may be performed for screening the highly virulent sub-genotype vgⅡ a.     

SXI2a基因在新生和格特隐球菌交配型鉴定中的作用

目的设计针对a交配型位点内特有的SXI2a基因的特异扩增法,评价其在鉴定新生和格特隐球菌所有主要基因型a交配型中的作用。方法在SXI2a基因4号外显子的序列保守区设计引物SXI2aF-SXI2aR特异扩增新生和格特隐球菌a交配型,并比较其与现有的针对STE20a、MFa或STE3a基因的特异扩增法及交配试验在鉴定新生和格特隐球菌所有主要基因型a交配型中的作用。结果针对SXI2a基因的特异扩增法准确鉴定受试的各主要基因型a交配型菌株,而针对STE20a、MFa或STE3a基因的特异扩增法均至少无法扩增1种以上主要基因型的a交配型。部分受试菌株不能发生交配,交配试验无法鉴定其交配型。结论针对SXI2a基因的PCR扩增可鉴定新生和格特隐球菌各主要基因型的a交配型。SXI2aF-SXI2aR引物在快速鉴定a交配型中具有更好的通用性和特异性。     

PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较

目的 探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法 以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果 多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％ ～ 97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％ ～ 100％之间。分子发育树中，VNⅠ－VNⅣ基因型、VGⅠ－VGⅣ基因型分别聚在一类。结论 针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

上海地区1366例浅部念珠菌病致病菌种分析

目的 分析上海地区1366例浅部念珠菌病的致病菌种构成及分布情况。方法 对1366例儿童与成人浅部念珠菌病的致病菌种进行菌种鉴定：采用科玛嘉平板、API20C AUX等鉴定手段常规鉴定;采用Pal平板、木糖同化试验、45 ℃生长试验鉴定都柏林念珠菌;采用分子鉴定方法鉴定近年发现的新种,包括Candida orthopsilosis、Candida metapsilosis、Candida fermentati、Candida nivariensis、Candida bracarensis。对致病菌种的构成及分布情况进行分析。 结果 1366例浅部念珠菌病的主要致病菌为白念珠菌（占79.0%）,排在2 ~ 4位的依次为近平滑念珠菌（9.5%）、热带念珠菌（2.9%）和季也蒙念珠菌（1.9%）,致病株中包括念珠菌新种Candida orthopsilosis（2株）和Candida metapsilosis（4株）;儿童患者与成人患者的致病菌种构成差异有统计学意义（?字２ = 196.46,P < 0.01）,其中非白念珠菌分离率分别为14.4%和45.8%。结论 白念珠菌仍为浅部念珠菌病的主要致病菌;新种Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis可引起浅部念珠菌病。与儿童病例相比,成人病例中非白念珠菌的分离比例明显上升。     

新生隐球菌交配与致病性的关系

新生隐球菌是导致人类和动物发生致命感染的病原真菌，在免疫抑制患者，尤其是AIDS患者中发病率更高。根据不同的地理分布、生物学特性、致病特点将其分为3个变种，即格鲁比（Cryptococcus neofoFmans var．grubii）、新生（C．neofoFmans var．neoformans）和格特变种（C．neo formarts var．gattii）。其中，格鲁比和新生变种主要侵犯免疫受损患者，     

新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的分子鉴定

目的 评价限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法检测α和a交配型位点内GEF1α/a基因片段在鉴定新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型中的作用.方法 筛选交配型位点内的GEF1α/a基因进行PCR-RFLP分析.根据各基因型和交配型参考株的GEF1α/a基因保守序列设计引物,扩增受试新生和格特隐球菌GEF1α/a基因部分片段.利用DNAMAN和Vector NTI软件进行序列比对、限制性图谱分析、限制性内切酶的筛选和模拟电泳.选择EcoTl4 Ⅰ和Hap Ⅱ限制性内切酶分别对125株新生和格特隐球菌的GEF1α/a基因扩增片段进行RFLP分型.结果 所有受试的82株新生隐球菌和43株格特隐球菌均扩增出1 300 bp大小片段,而罗伦隐球菌、白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、阿萨希毛孢子菌、烟曲霉和黄曲霉参考株均扩增阴性.RFLP分型准确鉴定所有125株新生和格特隐球菌的种、变种、基因型和交配型.结论 针对GEF1α/a基因片段的PCR-RFLP方法特异性高、稳定性好,适用于新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的同步和快速鉴定以及进一步的分子流行病学分析.