切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体

目的 通过切胶免疫制备人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备提供抗原解决方案.方法 将腮腺液经超滤法浓缩蛋白后,进行SDS-PAGE分析,切取分子量约为50-65kDa的高丰度蛋白条带,研磨后注射新西兰大耳白兔诱导产生免疫应答并制备兔抗人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,并应用蛋白免疫印记(Western blot)等方法进行抗体鉴定.结果 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体.结论 成功制备和鉴定了人腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体,为下一步腮腺液高丰度蛋白单克隆抗体制备及唾液蛋白质组学研究奠定基础.     

唾液蛋白质组学唾液样本制备的方法学初探

目的：通过对唾液淀粉酶单克隆抗体的制备和鉴定,寻找蛋白质组学研究中样本制备关键环节的可行性方案,为日后唾液蛋白质组学研究奠定基础。方法：将腮腺液经超滤法浓缩蛋白后,进行SDS-PAGE分析,切取分子量为50～65kDa的高丰度蛋白条带,研磨后注射BALB/c小鼠,诱导产生免疫应答并制备人唾液淀粉酶单克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验和蛋白免疫印记等方法鉴定。结果：成功制备和鉴定了人唾液淀粉酶单克隆抗体。结论：成功制备和鉴定了唾液淀粉酶单克隆抗体,为唾液蛋白质组学研究中样本制备提供解决方案。     

Sialin(SLC17A5)在腮腺、颌下腺及颌下腺细胞系HSG表达的初步分析

目的研究唾液酸转运蛋白Sialin在正常涎腺组织和颌下腺细胞系HSG的表达.方法应用基因芯片检测正常人腮腺、颌下腺组织Sialin编码基因SLC17A5的表达;提取腮腺、颌下腺组织及颌下腺细胞系(HSG)总RNA,通过RT-PCR在基因水平上验证SLC17A5基因的表达;提取HSG细胞总蛋白,用免疫印迹法检测Sialin在蛋白水平表达.结果基因芯片检测到Sialin编码基因SLC17A5基因在正常人腮腺、颌下腺均有表达,表达比值分别为226、206.9,不存在表达差异;RT-PCR验证芯片结果并在其他涎腺样本及颌下腺细胞系HSG中能扩增出其全部翻译区1485bp的片段,应用商业化的抗体能够在HSG细胞检测到Sialin相应的约54KDa蛋白.结论正常腮腺、颌下腺组织和颌下腺细胞系HSG均表达SLC17A5基因,但是唾液酸转运蛋白Sialin在组织、细胞内定位和功能需要进一步研究.     

重组2型腺病毒相关病毒体外基因转导人胚肾293细胞与人颌下腺细胞的研究

目的研究重组2型腺病毒相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 2,rAAV2)介导的β-半乳糖苷酶基因和人红细胞生成素(human erythropoietin,hEPO)基因在人胚肾293(human embryonic cell 293,HEK293)细胞与人颌下腺细胞(human submandibular gland,HSG)的体外表达,为进一步的涎腺基因转导提供研究基础.方法用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为105的携带β-半乳糖苷酶基因的腺病毒相关病毒(rAAV2LacZ)转导HEK293细胞和HSG细胞,组织化学方法检测β-半乳糖苷酶基因表达,计数转导效率.用MOI分别为103、104和105的携带hEPO基因的腺病毒相关病毒(rAAV2hEPO)转导HEK293细胞和HSG细胞,ELISA法测定hEPO含量.结果rAAV2介导的β-半乳糖苷酶基因转导HEK293与HSG后组织化学染色显示转导率分别为68.2%和66.3%.rAAV2介导的hEPO基因转导HEK293细胞与HSG细胞后,随MOI值增加和时间的延长,hEPO的浓度增高.MOI=105,转导后72h时,HEK293细胞培养基中的hEPO浓度达到482.54mU/ml,HSG细胞培养基中的hEPO浓度为458.22 mU/ml.结论rAAV2载体在体外可以有效转导涎腺细胞,可以进一步应用于动物体内实验.     

涎腺细胞氯离子通道的研究

氯离子通道是一大类在各种细胞中广泛存在的离子通道,对细胞功能有重要影响。迄今为止,至少在哺乳动物涎腺细胞发现了五种不同性质的氯离子通道。本文重点综述了近年来涎腺氯离子通道特点、生理功能及在病理状态下的可能作用等方面的研究进展。     

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。     

p16、p21在涎腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤中的表达

目的:研究涎腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤中抑癌基因p16、癌基因rasp21的表达,探讨基因在涎腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤发生发展中的作用。方法:应用免疫组化SABC法检测正常涎腺组织、多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤中p16、p21的表达。结果:(1)p16表达:正常组阳性表达率为100%,良性组为95%,恶性组为82.5%。正常组与恶性组、良性组与恶性组相比存在显著性差异(P<0.05),正常组与良性组之间无统计学差别。(2)p21表达:正常组阳性表达率为0%,良性组为65%,恶性组为72.5%。正常组与良性组或恶性组相比均具有显著性差异(P<0.01),但良性组与恶性组相比无显著差别。结论: 1.p16基因变异在涎腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤的发生发展中起一定作用;2.ras基因产物p21过表达可能对涎腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤的早期发生起重要作用。