去骨瓣减压术对大鼠缺血缺氧性脑损伤后缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子表达的影响

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,它通过对下游靶基因的调控,使细胞对缺氧产生适应性反应[1].有研究结果显示,脑组织缺血缺氧可导致脑缺血半暗带HIF-1α的表达增加,并诱导血管内皮生长因子(VEGF)过量表达,刺激血管新生,改善局部血供,减轻缺血后的脑损伤[2]1.本研究旨在观察去骨瓣减压术对局灶性脑缺血大鼠梗死灶周HIF-1α、VEGF表达的影响,探讨该手术脑保护作用的可能机制.     

人卵巢癌动物模型中循环无细胞DNA含量与瘤负荷及细胞凋亡的关系

目的 研究循环无细胞DNA(cfDNA)的来源,探讨血清cfDNA水平在卵巢上皮性癌临床诊断及病情监测中的意义.方法 利用裸鼠制备人卵巢癌细胞荷瘤模型及腹水模型,并对部分裸鼠实施化疗.应用半定量PCR法检测裸鼠血清及腹水中ALU115、ALU247以及CA125-cfDNA舍量,TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况,并且对荷瘤裸鼠化疗前后血清cfDNA水平变化进行检测.结果 cfDNA在各组荷瘤裸鼠的血清及腹水中均有表达,在腹水中的表达值与同一个体血清中含量相比没有显著性差异.血清cfDNA水平与瘤负荷成正相关.cfDNA在化疗后1 d达最大值,而后缓慢下降,在化疗10 d其值明显低于化疗前水平.化疗前后cfDNA与肿瘤细胞的凋亡率呈正相关.结论 血清cfDNA来源于肿瘤细胞,并与细胞凋亡和坏死有关,可能为卵巢上皮性癌的诊断及病情监测提供理论依据.     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

胶质瘤中变异型IκBα的表达与抑制肿瘤浸润的研究

目的 探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type PA,uPA)和其受体(uPA-receptor,uPAR)表达的调控作用及其与肿瘤浸润行为的关系.方法 构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株;用Transwell法测定肿瘤细胞的迁移能力;RT-PCR技术检测细胞内uPA、uPAR在RNA水平的表达;制作裸鼠皮下异位移植瘤生长模型,并采用免疫组化法分析肿瘤组织中uPA和uPAR的表达.结果 Transwell法测定G36△-M组肿瘤细胞的迁移能力明显降低;RT-PCR及肿瘤组化染色结果显示,uPA和uPAR在G36△-M组中的表达显著低于G36△、G36△-W和G36△-P三组,而在后三组间的表达无统计学意义.结论 IκBαM基因在RNA和蛋白水平均可显著降低人类恶性胶质瘤中uPA和uPAR的表达,进而减弱肿瘤细胞的浸润能力,抑制肿瘤组织的浸润.     

金属烤瓷全冠外形高点位置对修复体强度的影响

目的 研究种植体烤瓷熔附金属全冠的外形设计与修复体强度的关系。方法 分别制作外形高点在（牙合）1／4、1／2、2／3的标准种植体金属烤瓷冠样本。通过加载比较其抗压强度并进行相应的扫描电镜观察分析其微观结构变化。结果 外形高点位置在（牙合）1／4处样本抗压强度最差，外形高点在（牙合）2／3处样本的抗压强度最大。结论 种植体金属烤瓷冠外形高点的位置与修复体抗压强度有关。     

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶- Ⅰ（XT- Ⅰ）基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖（PG）的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT- Ⅰ基因序列，设计短链寡核苷酸，化学合成后经退火形成双链DNA片段，克隆到Pgenesil- 1载体中，构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，行酶切及核酸测序鉴定；将构建的XT- Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，流式细胞术检测转染效率，并采用半定量RT- PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT- Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实，构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确；转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光；流式细胞术测定转染效率平均为50.26%；RT- PCR结果显示，WJ3显著抑制XT- Ⅰ mRNA的表达，抑制率为72.39%；Western blot结果显示，WJ3有效抑制XT- Ⅰ的蛋白表达，抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT- Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6，其中WJ3可高效抑制XT- Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达，为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。     

变异型IκBα抑制胶质瘤中Epo、EpoR的表达及肿瘤生长的研究

目的 探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中促红细胞生成素(Epe)和其受体(EpoR)表达的调控作用及其与肿瘤血管新生的关系.方法 建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株并制作裸鼠皮下异位移植瘤生长模型,采用免疫组织化学法分析肿瘤组织中Epo、EPOR和FactorⅧ的表达.同时分析肿瘤组织中的微血管密度以及运用流式细胞术分析凋亡率.结果 各组肿瘤组织中,Epo的阳性细胞表达率分别为(54.8±12.4)%(G36△组)、(65.7±15.6)%(G36△-W组)、(6.1±10.1)%(G36△-M组)和(68.3±11.4)%(G36△-P组);EpoR的阳性表达率分别为(33.6±16.4)%(G36△组)、(37.3±13.9)%(G36△-W组)、(2.5±17.5)%(G36△-M组)和(37.2±14.4)%(G36△-P组).Epo和EPoR在G36△-M组中的表达显著低于其他三组,而在后三组间的表达差异无统计学意义.各肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡率分别为(8.31±1.85)%(G36△组)、(8.06±2.08)%(G36△-W组)、(28.35±3.26)%(G36△-M组)及(7.40±2.35)%(G36△-P组),G36△-M组中的肿瘤细胞凋亡率明显高于其他三组;而G36△-M组中的微血管密度明显低于其他各组.结论 IκBαM基因可显著降低人类恶性胶质瘤中Epo和EpoR的表达,进而减弱肿瘤细胞的促血管新生的能力,促进肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤组织的生长.     

人脑胶质瘤中COX-2表达及其与血管新生关系

目的 检测COX-2、VEGF和CD34在人脑胶质瘤中的表达,探讨COX-2、VEGF与胶质瘤微血管密度及血管新生之间的关系及意义.方法 用免疫组化SP法检测80例胶质瘤及10例正常脑组织中COX-2、VEGF和CD34的表达.结果COX-2与VEGF阳性细胞在坏死区周围及血管密集的区域分布密集,80例胶质瘤中二者表达的阳性率分别为68.8%和72.5%,正常脑组织中无表达;COX-2、VEGF的表达与MVD之间成正相关(r=0.927,r=0.939,P<0.05),COX-2与VEGF的表达成正相关(r=0.885,P<0.05),胶质瘤病理级别与COX-2、VEGF、MVD之间均成正相关(r=0.894,r=0.927,r=0.865,P<0.05).结论 COX-2和VEGF在胶质瘤的生长和进展过程中发挥重要作用,与其恶性度关系密切;COX-2可能通过上调VEGF的表达促进肿瘤组织血管新生.     

改良血管穿刺法大鼠蛛网膜下腔出血模型的制作及评价

目的 探讨改良血管内穿刺法制作大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)模型的制作方法,以及此模型蛛网膜下腔积血分布、吸收与神经元损伤病理特征的动态变化规律.方法 SD大鼠随机分为正常、假手术和手术组,采用改良血管内穿刺法制作SAH模型,观察各组脑组织的大体形态,以及手术组各个时间点蛛网膜下腔内血液分布情况;通过苏木素-伊红(HE)染色,观察神经组织的病理学变化.结果 3～24 h蛛网膜下腔的积血由穿刺的局部脑底面逐渐向大脑凸面蛛网膜下腔弥散;48 h第四脑室可见明显积血;大脑皮层神经元水肿随时间的增加逐渐加重,24 h达到水肿高峰,并持续到48 h;7 d时神经元水肿基本恢复.结论 改良血管穿刺是制作SAH模型较为理想的方法,蛛网膜下腔内血液的吸收再分布规律及神经元的动态损伤过程为SAH模型构建的评价提供了更完备的实验数据.     

沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的构建H-ras靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,研究其对人涎腺腺样囊性癌裸鼠成瘤的抑制作用及其对移植瘤细胞增殖活性及细胞凋亡率的影响.方法构建含H-ras靶向特定序列的真核表达质粒pHRAS,稳定表达pHRAS质粒的细胞为实验组,未处理的SACC-M细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型,计算成瘤率;移植瘤原代培养检测质粒表达及瘤细胞增殖活性;免疫组织化学法检测瘤内H-ras蛋白表达;采用组织学观察、流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况.结果pHRAS质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组,原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光.实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少,实验组肿瘤细胞凋亡率为(41.55±4.25 )%,明显高于对照组的(4.73±1.35) %(P＜0.05).结论shRNA沉默H-ras基因能抑制SACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,在体内有效下调H-ras蛋白的表达,且对肿瘤细胞具有促凋亡作用.