质谱多反应监测技术（MRM）及其在蛋白质细胞器定位与定量研究中的应用

肝脏中的蛋白质只有处于特定的亚细胞中才能发挥其功能。研究特定蛋白质的亚细胞定位对于肝脏功能研究有重要意义[1]。对于多定位的蛋白质,确定其在不同细胞器中量的变化,也是肝脏蛋白表达谱研究的重要内容之一。目前,蛋白亚细胞定位分析方法主要包括实验方法和理论预测方法两大类。其中实验方法主要有绿色荧光蛋白（GFP）-激光共聚焦显微镜法、免疫电镜胶体金标记法、差速离心-免疫印迹法等。理论预测方法主要根据蛋白质的氨基酸组成、氨基酸对组成以及位置特异性打分矩阵等分类特征,采用模糊k近邻、支持向量机及分组重量编码法等方法进行理论预测。实验方法不仅分析通量低,还需要特异的抗体,并且在定位的同时难以实现定量分析。对于不同的理论预测方法而言,往往会得出不同的结论,准确度差。因而需要建立一种可以实现通量化、准确地进行蛋白亚细胞定位及定量分析的方法。 近年来,质谱多反应监测技术（MRM）在蛋白质定量分析方面的应用越来越广泛^[2]。该技术通过特异性的检测预先设置的母离子和子离子,在母离子和子离子两个水平排除其它离子的检测干扰, 从而增强检测的特异性。同时结合同位素稀释技术可以同时实现对多种目标蛋白质的绝对定量。由于该技术采用特异性检测预设的母子离子对的方法,从而保证了检测的重现性。而依据特定子离子和相应的同位素标记子离子对峰面积进行绝对定量的方法保证了定量的可靠性。同时可以批量化同时进行多个蛋白质的亚细胞定量及定位分析。因而本研究利用MRM技术,用于目标蛋白在肝脏细胞器中定位及定量分析研究。 鉴于本研究样品采用蔗糖密度梯度离心法制备,首先对细胞器样品的分离效果进行评价。选用文献报道^[3]的正向和反向免疫评价抗体蛋白,包括线粒体Marker蛋白COX4、VDAC和Cytc,细胞核Marker蛋白Lamin B,质膜Marker蛋白Na＋K＋-ATPase等。利用MRM技术分析蛋白在不同细胞器样品中的含量,从而对细胞器样品纯度进行评价。同时考察方法的灵敏度,重现性以及动态范围。 在确定了细胞器样品纯度的基础上,利用MRM质谱技术对选定的部分目标蛋白进行了定位分析。根据这些蛋白在不同细胞器样品中的含量,判断其在不同细胞器样品中的定位。并选择其中一些蛋白进行GFP-激光共聚焦显微镜分析,与基于MRM技术的定位分析结果进行对比验证。     

2011-2019年北京市市售保健食品微生物学检验结果与分析

目的 了解北京市市售保健食品的微生物污染情况,为保健食品安全质量保障提供科学依据.方法 对2011-2019年北京市市售的4 325份保健食品按GB 4789规定方法检测菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、致病菌及其他污染菌,并进行统计与分析.结果 4 325份保健食品总合格率为98.71％(4 269/4 325),年度...     

盐酸厄洛替尼片微生物限度检查方法研究

目的盐酸厄洛替尼片属于口服制剂,根据中国药典2015年版四部制剂通则0101片剂要求,片剂在生产和贮存期间微生物限度应符合要求,建立了盐酸厄洛替尼片的微生物限度检查方法,并对方法进行验证和评价。方法根据2015年版《中国药典(四部)》通则1105非无菌产品微生物限度检查中的微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查中的控制菌检查法和通则1107非无菌药品微生物限度标准进行方法适用性试验。将中和剂3%Tween-80、0.3%卵磷脂添加至pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液,需氧菌总数计数(稀释成1:100)及霉菌和酵母菌总数计数(稀释成1:50)均采用平皿法,控制菌检查法采用培养基稀释法(500ml TSB)。结果 5种试验菌的回收试验结果均在0.5～2.0之间。结论中和法能有效去除盐酸厄洛替尼片的抑菌成分,不影响污染微生物的生长,该方法适用于盐酸厄洛替尼片微生物限度的检查。