hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植在急性心肌梗死模型心肌损伤修复中的作用

目的观察人肝细胞生长因子（hHGF）基因修饰的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）移植在急性心肌梗死模型心肌损伤修复中的作用。方法用携带hHGF基因的腺病毒基因表达载体以150感染强度（MOI）转染hUC-MSCs,获得hHGF基因修饰的hUC．MSCs。30只广西巴马小型猪制作急性心肌梗死模型。造模成功后的24只猪随机分为A、B、c、D组各6只。C组采用微量注射器将hUC-MSCs悬液经心外膜呈矩阵分布多点注入梗死组织,D组以同样方法注入hHGF基因修饰的hUC．MSCs悬液,B组注入等量PBS,A组只造模。术后6周,经核素心肌灌注显像法检测心肌灌注与心脏功能变化;Masson三色法检测存活心肌,免疫组化法检测新生血管光密度。结果A、B、C、D组灌注质量缺损百分率差值（AMDP）分别为4．33％±1．86％、3．67％±1．21％、-0．83％±1．17％、-0．17％4-1．33％,左室射血分数差值（ALVEF）分别为-9．17％4-2．48％、-9．33％±2．73％、1．00％±3．22％、0．50％±2．26％,C、D组与A、B组的AMDP、ALVEF比较,P均〈0．001。A、B、c、D组在梗死交界区域存活的心肌累计光密度（IOD）值分别为313914±4794、31520±4164、72271±4844、79862±3603,新生血管IOD值分别为1363±157、1380±95、4271±398、4782±225,C、D组与A、B组比较,P均〈0．001;D组与C组比较,P〈0．05。结论hHGF基因修饰的hUC-MSCs可在急性心肌梗死模型的梗死区域内部分存活,在促进血管新生的同时减轻心肌纤维化,改善梗死区域的心肌存活和收缩功能,抑制心室重塑的发生。     

水蛭素融合蛋白研究进展

水蛭素是一种高效特异的凝血酶抑制剂，临床上用于血栓病的预防和治疗，但它半衰期短、出血副作用强和功能单一。近年来，通过把水蛭素与某些功能蛋白融合表达来解决这些问题，得到的融合蛋白或在体内延长水蛭素的半衰期，或降低其出血副作用，或带来新的功能，如：溶栓、抑制血小板凝集、特异寻靶等。本文对近年来国内外水蛭素融合蛋白研究状况进行综述。     

慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织差异基因的表达：正常组、模型对照组及中药治疗组的比较

背景：许多疾病都伴有基因表达的改变，能够为认识疾病的发病机制及治疗提供有价值的线索。 目的：采用基因芯片技术筛查慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织中差异基因的表达情况。 设计：开放性实验。 单位：山东中医药大学附属医院，解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，山东中医药大学。 材料：实验于2005-04／10在山东中医药大学附属医院中心实验室进行。①选取SPF级健康雄性50d龄Wistar大鼠15只，随机数字表法分为正常组、模型对照组、中药治疗组，5只／组。②基因芯片类型为大鼠BiostarR-40S（上海博星基因芯片有限公司，批号G050510010052）。 方法：①模型对照组、中药治疗组大鼠采用改良烟熏＋气管滴加脂多糖的方法建立慢性阻塞性肺疾病模型。光学显微镜下观察大鼠气道病理改变，若出现气道黏膜充血水肿，上皮细胞变性坏死，肺内支气管的管腔及周围慢性炎性细胞浸润，管壁周围平滑肌和纤维细胞增生；间隔变薄、断裂，肺泡扩大融合；小动脉血管壁增厚，管腔变小，周围炎性细胞浸润，说明造模成功。②造模成功后第30天，中药治疗组灌服浓度为0．65g／mL的自制中药合剂（麻黄，杏仁，黄芪等），2mL/次，1次／d，连续给药14d。模型对照组每天给予2mL生理盐水灌胃。正常组不做任何干预，相同室内环境下自由饮食饮水。③给药完毕后处死各组大鼠，进行总RNA提取、探针的标记与杂交、洗片，采用芯片图像分析软件分析芯片灰度扫描图，得到芯片上每个基因点的原始信号值（包括前景信号值和背景信号值），从而进行差异表达基因的判定。检验水准是Ratio值大于2．0为上调基因，小于0．5为下调基因。为了提高检验的可靠性，本实验将检验水准设为Ratio值〉2．5为上调基因。Ratio值〈0．375为下调基因。 主要观察指标：①与正常组比较模型对照组的差异表达基因。②与正常组比较中药治疗组的差异表达基因。③与模型对照组比较中药治疗组的差异表达基因。 结果：15只大鼠全部进入结果分析。①模型对照组的基因表达情况较正常组有明显变化，差异表达基因达57个，涉及免疫、代谢、信号转导、基因表达调控、细胞周期、细胞转运、细胞迁移及纤维化等。②中药治疗组的基因表达大多恢复到正常组水平，与正常组比较差异表达基因减少到11个，涉及应激反应、信号转导及细胞骨架等。③与模型对照组比较，中药治疗组的差异表达基因有7个，涉及免疫及神经递质的分泌。 结论：大量的基因表达改变可能是慢性阻塞性肺疾病发病机制的原因之一，而经药物治疗后，大多数差异表达基因能够恢复到正常水平，有利于纠正慢性阻塞性肺疾病的病理改变。     

利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究

目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y（carboxypeptidase Y,CPY）基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。     

Ala-Gln和BCAA对创伤大鼠静脉营养支持作用的实验研究

目的观察富含丙氨酰谷氨酰胺(Ala—Gln)和支链氨基酸(BCAA)的氨基酸注射液对创伤大鼠的静脉营养支持效果。     

富含谷氨酰胺二肽的20种结晶氨基酸对短肠综合征大鼠免疫功能的影响

目的观察富含谷氨酰胺二肽和支链氨基酸的新型20种结晶氨基酸配制的全肠外营养液对短肠综合征大鼠免疫功能的影响。方法40只Wistar雄性大鼠随机分为谷氨酰胺二肽组、标准组、无氮组及虚拟对照组,观察各组动物之间外周血T淋巴细胞转化率、T淋巴细胞亚群(CD4 ／CDS- )以及血清肿瘤坏死因子(TNF)等免疫指标的变化。结果谷氨酰胺二肽组与标准组及无氮组相比,T淋巴细胞转化率、CD4 ／CD8 及TNF均有不同程度的增高。结论富含谷氨酰胺二肽和支链氨基酸的20种结晶氨基酸更有利于手术后创伤应激期免疫功能的恢复,增强其生存能力。     

慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织差异基因的表达:正常组、模型对照组及中药治疗组的比较

背景:许多疾病都伴有基因表达的改变,能够为认识疾病的发病机制及治疗提供有价值的线索。目的:采用基因芯片技术筛查慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织中差异基因的表达情况。设计:开放性实验。单位:山东中医药大学附属医院,解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所,山东中医药大学。材料:实验于2005-04/10在山东中医药大学附属医院中心实验室进行。①选取SPF级健康雄性50d龄Wistar大鼠15只,随机数字表法分为正常组、模型对照组、中药治疗组,5只/组。②基因芯片类型为大鼠BiostarR-40S(上海博星基因芯片有限公司,批号G050510010052)。方法:①模型对照组、中药治疗组大鼠采用改良烟熏 气管滴加脂多糖的方法建立慢性阻塞性肺疾病模型。光学显微镜下观察大鼠气道病理改变,若出现气道黏膜充血水肿,上皮细胞变性坏死,肺内支气管的管腔及周围慢性炎性细胞浸润,管壁周围平滑肌和纤维细胞增生;间隔变薄、断裂,肺泡扩大融合;小动脉血管壁增厚,管腔变小,周围炎性细胞浸润,说明造模成功。②造模成功后第30天,中药治疗组灌服浓度为0.65g/mL的自制中药合剂(麻黄,杏仁,黄芪等),2mL/次,1次/d,连续给药14d。模型对照组每天给予2mL生理盐水灌胃。正常组不做任何干预,相同室内环境下自由饮食饮水。③给药完毕后处死各组大鼠,进行总RNA提取、探针的标记与杂交、洗片,采用芯片图像分析软件分析芯片灰度扫描图,得到芯片上每个基因点的原始信号值(包括前景信号值和背景信号值),从而进行差异表达基因的判定。检验水准是Ratio值大于2.0为上调基因,小于0.5为下调基因。为了提高检验的可靠性,本实验将检验水准设为Ratio值>2.5为上调基因,Ratio值<0.375为下调基因。主要观察指标:①与正常组比较模型对照组的差异表达基因。②与正常组比较中药治疗组的差异表达基因。③与模型对照组比较中药治疗组的差异表达基因。结果:15只大鼠全部进入结果分析。①模型对照组的基因表达情况较正常组有明显变化,差异表达基因达57个,涉及免疫、代谢、信号转导、基因表达调控、细胞周期、细胞转运、细胞迁移及纤维化等。②中药治疗组的基因表达大多恢复到正常组水平,与正常组比较差异表达基因减少到11个,涉及应激反应、信号转导及细胞骨架等。③与模型对照组比较,中药治疗组的差异表达基因有7个,涉及免疫及神经递质的分泌。结论:大量的基因表达改变可能是慢性阻塞性肺疾病发病机制的原因之一,而经药物治疗后,大多数差异表达基因能够恢复到正常水平,有利于纠正慢性阻塞性肺疾病的病理改变。     

人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较

目的：探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞（ MSCs）的分离培养和生物学性状的差异,为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs,酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态,流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异,通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力,体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观,两种细胞均高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40．8 h,52．12％处于G0／G1期,脐带MSCs的群体倍增时间为39．5 h,57．50％处于G0／G1期,表明两者增殖能力旺盛,且无明显差异;两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性,两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。     

过氧化氢诱导间充质干细胞衰老模型的建立

目的：建立间充质干细胞（ MSCs）衰老模型,探讨其衰老的相关生物学改变,从而为衰老相关研究提供有效的细胞模型工具。方法取新生胎盘组织利用酶消化法分离纯化获得人胎盘源间充质干细胞（ MSCs ）。将第3代细胞接种到培养皿。在完全培养基基础上分别加入终浓度100、200、300μmol／L的过氧化氢（ H2 O2）培养2 h,处理结束后更换为完全培养基继续培养24 h。进行MTT、细胞周期分析、分化诱导实验和β－半乳糖苷酶染色验证衰老MSCs模型的建立,应用RT－PCR法检测衰老相关基因p16、p21、p53 mRNA的表达变化。结果与对照组比较,200μmol／L H2 O2作用2 h,倒置显微镜下见MSCs形态较为宽大扁平;MTT 光密度值显著下降,流式检测结果显示细胞周期处于G0／G1期细胞比例增加;成脂、成骨和成软骨分化能力减弱;β－半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高;p16、p21、p53 mRNA表达水平显著升高。结论200μmol／L H2 O2作用2 h可建立MSCs体外衰老模型,该模型细胞的生物学变化可能是由p16、p21、p53细胞周期蛋白的活性调节引起的。