脊髓灰质炎病毒中和抗体检测血清参考品的制备及稳定性

目的 制备抗脊髓灰质炎(脊灰)病毒血清作为检测参考品,并研究其稳定性.方法 用1、2、3型脊灰病毒分别接种非洲绿猴肾细胞,收获病毒液,超滤浓缩后纯化病毒抗原,并进行蛋白含量和纯度检测.用纯化的病毒抗原免疫新西兰白兔获得分别抗3个型别的血清,过滤、分装、冻干后,进行无菌检验、支原体检验、水分测定,用微量细胞病变抑制法进行特异性检测.3名实验员各标定5次候选参考品的中和抗体效价,计算变异系数.血清放置于-20℃进行稳定性分析.结果 纯化的1、2、3型脊灰病毒抗原蛋白含量分别为12.3、10.4、9.8μg/ml.电泳蛋白条带的相对分子质量与文献报道一致.高效液相色谱法检测的1、2、3型脊灰病毒抗原蛋白纯度分别为100％、99％和96％.抗各型脊灰病毒血清仅可中和对应型别,而不能中和另两个型别脊灰病毒或肠道病毒.无菌检验、支原体检验结果及水分含量(均低于3％)均符合药典要求.血清参考品的抗1、2、3型脊灰病毒中和抗体效价分别为73 587、3 264、34 857.候选参考品在-20℃放置5年后中和抗体效价未降低(t=-1.25,P=0.225).结论 制备的抗1、2、3型脊灰病毒冻干血清参考品稳定性好,适用于检测Sabin株脊灰灭活疫苗免疫原性及脊灰病毒特异性中和抗体.     

人类肠道病毒71型的研究进展

肠道病毒71型是引起手足口病的主要病原体之一,其感染还可导致多种与神经系统相关的疾病,致残率及病死率较高.近年来,EV71感染在全球范围呈现上升趋势,2008年我国也有较大规模流行.本文对EV71的病原学特征、流行病学特征以及相关最新研究进展等方面作一综述.     

Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用

目的  建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV）D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价。方法  以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水。牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体（多抗）和小鼠单抗。以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA。对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证。结果  纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80%和90%以上。经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000、1:10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1:10 000、1:20 000、1:10 000。建立的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4~13.0、0.4~12.0和0.4~20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99。该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应。用该法对高、中、低浓度样品进行测定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值（×100%）分别为97%～111%、91%～104%和95%～102%、相对标准偏差分别为≤7%、≤9%和≤10%;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势。结论  建立了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价。     

肠道病毒71型抗原定量检测方法的建立

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原的定量检测方法,用于EV71疫苗生产过程中EV71抗原含量的监测.方法 用EV71抗原免疫新西兰兔制备抗EV71多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记.采用双抗体夹心ELISA法建立抗原检测系统.以EV71国家抗原标准品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的线性范围和定量限,并对该方法的特异性、精密度、准确性、稳定性及适用性等进行验证.结果 建立的ELISA法的线性范围为5～80 U/ml,定量限为5 U/ml,线性决定系数均大于0.990 0;不同浓度样品回收率为85.0％～110.0％,变异系数均小于15％;置于2～8℃及37℃3、6d的抗体包被板对不同浓度样品的检测值变异系数均小于15％;该方法可特异性检测EV71原液,与非EV71样品无交叉反应.结论 建立了EV71抗原定量检测方法,为EV71疫苗生产工艺过程的质量控制奠定了基础.     

Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备及免疫原性评价

目的  建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine, IPV）生产工艺并评价其免疫原性。方法  采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒,制备3价Sabin株IPV（Sabin strain IPV, sIPV）。通过ELISA检测D抗原含量。检测病毒滴度,电子显微镜下观察纯化病毒形态并电泳鉴定,分析抗原纯度,同时检测纯化原液宿主细胞残余DNA和蛋白含量。通过大鼠体内接种法比较sIPV和野生株IPV免疫原性,并观察中和抗体滴度变化。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型收获液D抗原含量分别为2 437、365、1 253 DU/ml,病毒滴度分别为每毫升8.4 、7.8和7.9 lg半数细胞培养物感染量。纯化病毒抗原纯度均﹥99%。电子显微镜下观察可见直径20~30 nm病毒颗粒,电泳鉴定正确。纯化原液的残余宿主细胞DNA和蛋白含量分别12.3 pg/500 μl和9.8 ng/ml。sIPV 3针免疫后在大鼠体内诱导产生抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体的几何平均滴度分别为9 397.8、554.7和4 668.4,与野生株IPV相比Ⅰ型明显增高（t=-3.429,P=0.004）,Ⅱ、Ⅲ型无明显差别,初免后19周内均维持在较高水平。结论 建立了稳定的sIPV生产工艺,制备的sIPV免疫原性较好。     

不同CA16流行株的相关生物学和VP1基因的分子生物学研究

目的 对柯萨奇病毒A组16型(CA16)病毒株进行生物学特征与基因背景研究,为CA16病原和疫苗的进一步研究奠定基础.方法 从咽拭子标本中分离出CA16病毒;通过中和鉴别试验和RT-PCR对病毒进行分子生物学鉴定;病毒的VP1基因序列测定后,与其他CA16序列进行比较,绘制种系发育树,确定病毒基因型;测定病毒滴度,观察病毒在Vero细胞上的噬斑形态;攻击乳鼠分析病毒的致病性.结果 从手足口病患者咽拭子标本中分离到6株病毒,采用肠道病毒通用引物可以从病毒感染细胞中扩增出约150 bp大小的目的产物带;采用CA16特异性引物可以从病毒感染细胞中扩增出210 bp大小的目的产物带.而采用EV71特异性引物未见特异性扩增条带.噬斑分析发现,6株病毒在Vero细胞上接种96 h后均能出现清晰的噬斑,其中BJ-3噬斑直径为4～5 mm,B J-5噬斑直径约为3 mm,B J-1、B J-2、BJ-4、BJ-6噬斑直径为1.5 ～2 mm;除BJ-3噬斑边缘模糊外,其余5株噬斑边缘整齐.该6株病毒均可被人CA16抗体阳性血清中和.在Vero细胞上连续传5代,滴度均在7.0LgCCID50/nl左右.基于VPI基因序列的种系发育分析结果显示,BJ-2、B J-4、B J-5属于C1亚型,BJ-1、BJ-3、BJ-6属于C3亚型,该6株病毒核苷酸同源性达90％以上,氨基酸同源性达99％以上.乳鼠攻击试验结果显示,BJ-3和BJ-5攻击后第4～5天乳鼠开始发病,后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状,至第6～7天全部死亡,正常对照组和其他病毒组直至攻击后第14天均无异常.结论 不同CA16病毒株的生物学特性有所不同,基因背景相近,致病性明显不同,需进一步了解中国流行的 CA16病毒株的致病特点,为疫苗的研发提供直接依据.     

肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）接种5年免疫持久性观察

目的 观察肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）疫苗III期临床试验接种5年的免疫持久性。方法 在III期临床试验免疫原性亚组中,对完成全程两针次免疫的免前抗EV71中和抗体阴性人群进行免疫后5年采血并检测抗EV71中和抗体,对0 d、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月同时具有抗EV71中和抗体检测数据人群评价免疫持久性。结果 共614名受试者完成5年免疫持久性血样采集并获得中和抗体检测结果,其中490名受试者同时具有0天、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月抗EV71中和抗体检测数据,疫苗组和安慰剂对照组分别为235名和255名。EV71疫苗免疫后5年,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率（100.00%）和抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）（369.57）均高于对照组（69.02%和55.58）。分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定标准,疫苗组阳性率（100%、99.57%、97.87%）均高于对照组（69.02%、61.96%、59.61%）。对不同年龄亚组进行分析,6~11、12~35月龄受试者免疫后疫苗组5年抗EV71中和抗体阳性（滴度≥8）率（均为100.00%）和抗体GMT（367.14、370.64）均高于对照组（66.67%、71.27%和53.43、63.66）。在EV71疫苗免疫后的各个时间点,疫苗组抗EV71中和抗体阳性率和GMT均高于对照组。结论 该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导良好的免疫原性,在免疫后5年依然保持较好的免疫持久性。     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。