他汀类药物肝脏安全性的研究进展

<正>随着他汀类药物在临床上的广泛使用,他汀类药物的安全性问题也一直备受关注,最常见的问题是血清转氨酶的升高。本文总结了他汀类药物肝脏安全性相关研究进展,为临床正确认识他汀类药物肝脏安全性及合理用药提供参考。他汀类药物,全称3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制药,是现阶段最有效的降脂药物,可显著减少心血管事件或冠心病病死率。目前国内常见的他汀类药物有氟伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀以及匹伐     

热毒宁注射液抗A16型柯萨奇病毒的研究

目的 研究热毒宁注射液对A16型柯萨奇病毒（CoxA16）感染Vero细胞及乳鼠模型的抗病毒作用。方法 采用75 TCID₅₀和50 TCID₅₀ CoxA16感染Vero细胞,建立细胞模型;5日龄ICR乳鼠ip感染1×10⁶ TCID₅₀ CoxA16,建立动物模型。观察热毒宁注射液对CoxA16感染Vero细胞病变的影响,体内实验观察热毒宁注射液对病毒感染乳鼠死亡率、生存时间、体质量变化率、临床症状评分的影响。结果 在Vero细胞模型上,热毒宁注射液（生药5.0 mg/mL）显著抑制75 TCID₅₀和50 TCID₅₀ CoxA16引起的细胞病变;在5日龄ICR乳鼠模型上,热毒宁注射液明显缓解CoxA16导致的乳鼠死亡,延长乳鼠生存时间和恢复乳鼠生长抑制;同时热毒宁注射液缓解病毒感染导致的临床症状。结论 热毒宁注射液在体内外均有抗CoxA16作用,为其临床用于治疗手足口病提供依据。     

五株EV71病毒毒力、免疫原性与基因组比较分析

目的对5株EV71分离株(LCH01、LCH02、BJ01、BJ02、AH01)进行毒力、免疫原性和基因组的比较分析。方法分别用5株EV71分离株攻击Balb/c乳鼠,比较毒力差异;免疫6～8周龄Balb/c小鼠后收集血清,ELISA检测抗体效价,微量中和实验检测中和抗体效价;反转录获得5株EV71的全长cDNA进行全基因组测序;最后,用CLC Main Workbench 5.5软件对序列进行比较分析。结果通过对VP1基因的比较分析发现,这5株EV71分离株均为C4a亚型。1周龄Balb/c小鼠经脑部注射LCH01株,表现出后肢瘫痪和后继死亡;而注射其它4株EV71的小鼠在观察了14 d之后仍然存活。5株EV71血清抗体效价为210～211,中和抗体效价为27～28,无显著差异。LCH01毒株与其它几株序列相比,在5′-NTR、3′-NTR、3D等处均有明显差异。结论这5株EV71分离株为近几年流行的C4a亚型,具有较高的免疫原性;LCH01毒株的毒力高于其它几株,从基因组水平上找到了差异序列,这为EV71疫苗评价和致病机制研究提供了实验数据和实验材料。     

手足口病CA16型VP1亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析

目的 制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析,为手足口病CA16疫苗的深入研究提供资料.方法 利用RT-PCR技术获得CA16 VP1基因,克隆到载体pFastBac HT A,与Bacmid DNA重组,转染Sf9昆虫细胞,重组CA16 VP1蛋白与Al(OH)_3佐剂混合制备重组CA16 VP1蛋白疫苗,腹腔免疫BALB/c小鼠,2次免疫后进行免疫效果初步评价.结果 用间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot法,证明重组CA16 VP1蛋白在昆虫细胞Sf9中得到表达,用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生,最佳免疫抗原剂量为20μg,其特异IgG效价为1:1600,中和抗体效价为1:250;通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定,证明诱导T细胞应答,诱发Th1/Th2型免疫应答.结论 CA16 VP1基因克隆成功,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,构建的蕈组CA16 VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础.     

CIP29对布鲁氏菌侵袭和巨噬细胞凋亡影响的初步研究

目的 研究CIP29在细胞中的定位及其对巨噬细胞凋亡和布鲁氏菌侵袭的影响.方法 通过RT-PCR方法从细胞中获取CIP29基因片段,并将其亚克隆入质粒载体pET28a和eGFP,构建原核表达质粒pET28a-CIP29和真核表达质粒eGFP-C IP29,原核表达质粒用于制备CIP29抗体,用于后续CIP29蛋白的检测;真核表达质粒用于转染巨噬细胞,通过荧光显微镜、Western blot技术检测CIP29在真核细胞中的表达及定位, Annexin-Ⅴ/PI双染检测其对细胞凋亡的影响,布鲁氏菌侵袭试验检测其对布鲁氏菌入侵巨噬细胞的影响.结果 获得了CIP29基因,构建的表达质粒pET28a-CIP29 和eGFP-CIP29经测序和双酶切鉴定,证实重组表达质粒构建成功.将pET28a-CIP29转化BL 21中,CIP29蛋白得到了表达,制备了特异性抗体,经ELISA检测效价达1∶25 600.进一步构建真核表达质粒eGFP-CIP29,转染细胞后,荧光显微镜观察结果显示其定位于核内,但也有部分扩散之胞质中,CIP29可诱导细胞的凋亡,但对布鲁氏菌侵袭的影响无统计学意义.结论 本研究获得CIP29重组蛋白,并制备了其多克隆抗体,CIP29瞬时高表达诱导巨噬细胞凋亡.     

CVA10候选疫苗病毒株的分离、鉴定及其致病性和免疫保护性研究

目的分离、筛选柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)病毒候选疫苗株,并对其免疫原性及免疫保护性进行评价,为CVA10疫苗的研制奠定基础。方法本研究从北京市儿童医院、军事医学研究院、北京市疾控中心共收集80个手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)标本,通过细胞培养法、RT-PCR的方法分离、鉴定CVA10病毒株。对病毒进行嗜斑纯化,各纯化病毒株与Al(OH)_3(0.5 g/ml)佐剂混合后制备原疫苗,免疫Balb/c小鼠,收集血清。应用交叉中和实验及抗体阳转率实验筛选候选CVA10疫苗株。筛选后T9疫苗株免疫ICR乳鼠,观察ICR乳鼠的致病情况。结果共分离出14株CVA10病毒株。交叉中和实验筛选得到4株候选疫苗株。最后阳转率实验确定T9为候选疫苗株。Al(OH)_3+CVA10灭活抗原在Balb/c小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,该抗体对Balb/c小鼠有保护作用。T9病毒免疫ICR乳鼠后,对乳鼠完全致死。结论筛选1株CVA10病毒候选疫苗株,CVA10候选疫苗对ICR乳鼠动物模型有致病性。     

布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学方法的建立

目的 建立布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,筛选布鲁氏菌保护性抗原.方法 利用双向电泳技术对实验条件下培养的布鲁氏菌疫苗株M5外膜蛋白进行分离,结合WB(Western blotting)技术寻找发生免疫反应的蛋白质.结果 21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框.这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白.结论 成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路.     

甲型H7N9流感裂解疫苗制备及免疫保护效果的评价

目的构建、拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株并制备甲型H7N9流感裂解疫苗,动物实验评价甲型H7N9流感裂解疫苗的免疫原性及免疫保护性效果。方法采用反向遗传学技术将A/Anhui/1/2013(H7N9)疫苗株的HA、NA基因和A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重配,转染细胞后筛选拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株,制备rgPR8-H7N9流感裂解疫苗抗原。腹腔注射免疫Balb/c小鼠,检测血清IgG、IgG1、IgG2a、HI效价,进一步用野生株攻毒,评价rgPR8-H7N9流感裂解疫苗的免疫保护效果。结果成功拯救甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9。制备的重配甲型H7N9流感裂解疫苗对小鼠产生较高的HI抗体效价。IgG1/IgG2a亚型检测结果表明小鼠体内以诱导体液免疫为主。攻毒实验显示甲型H7N9流感裂解疫苗能够有效降低肺部的病毒载量,肺组织病变显著减轻、体质量下降后趋于稳定,疫苗剂量达到15μg即可全部存活。A/Anhui/1/2013(H7N9)野生株流感病毒攻毒,甲型H7N9流感裂解疫苗能够达到保护小鼠效果。结论成功拯救重配甲型H7N9流感病毒疫苗候选株rgPR8-H7N9,制备的甲型H7N9流感裂解疫苗具有较好的免疫原性及免疫保护性,为H7N9流感裂解疫苗的研发及进入临床研究提供了实验依据。     

EV71型手足口病乳鼠动物模型的建立及免疫、内分泌及病理特征研究

目的建立EV71型手足口病乳鼠动物模型并进行免疫、致病特性研究。方法将临床分离的EV71病毒株经蚀斑纯化,3T3细胞适应,乳鼠驯化,最终获得1株能致死7日龄乳鼠的EV71毒株,命名为BJ09/07(GenBank Accession NO.JQ319054,EV71-BJ)。EV71-BJ感染7日龄ICR乳鼠后,观测临床疾病得分、体质量变化、死亡率并测定病毒载量、免疫分子、内分泌水平、组织病理损伤等病毒、免疫、内分泌、病理指标。结果 EV71-BJ毒株感染7日龄ICR乳鼠,其病毒毒力为150 LD50/ml,感染后不同时期肌肉病毒载量均高于脑中,至第4天达到高峰,后不断下降。至感染后第6天发病达高峰时做病理检测,相对于脑组织,肌肉中有更严重的淋巴细胞浸润,引起更严重的炎性分子升高。肌肉研磨液和血清中MCP-1、IFN-γ、IL-6和TNF-α显著升高,而肾上腺素和皮质醇未见明显变化。结论初步建立了EV71型手足口病乳鼠动物模型,为药物筛选、疫苗研发及免疫机理研究奠定了基础。     

EV71型vP1蛋白表达、纯化及免疫原性的初步评价

目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达新肠道病毒EV71 vP1蛋白(EV71vP1),并对EV71 vP1蛋白的免疫原性进行初步评价。方法利用RT-PCR技术获得EV71 vP1基因,将基因序列克隆到载体pFastBac HTA,通过转座反应,与Bacmid DNA重组,重组后转染Sf9昆虫细胞。采用透射电镜观察法、SDS-PAGE、Western-blot方法对vP1蛋白进行验证,利用ELISA、微量中和抗体方法对蛋白的免疫原性进行初步评价。结果 EV71 vP1蛋白相对分子量约为33KD,表达量约10mg/L;ELISA抗体效价为1∶900;中和抗体效价1∶800。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功的表达了EV71 vP1蛋白,并对其免疫原性做了初步评价,为今后EV71 vP1亚单位疫苗的研究提供参考。