ICOS/ICOSL在类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞的表达及临床意义

目的:检测初发类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)患者外周血淋巴细胞表面共刺激分子ICOS和ICOSL的表达,并探讨其临床意义。方法:采用流式细胞术和RT-PCR的方法,检测85例初发RA患者和50例健康对照(Healthy control,HC)外周血CD4+T细胞表面ICOS及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面ICOSL的表达,比较15例初诊RA患者治疗前后ICOS和ICOSL表达水平变化,分析其临床意义。结果:RA患者外周血中ICOS/ICOSL的mRNA的表达水平显著高于HC。RA患者外周血CD4+T细胞表面ICOS表达显著增高[(7.08±4.72)%vs(3.01±1.39)%,P0.0001]。RA患者外周血中CD14+单核细胞[(5.77±3.45)%vs(3.64±1.43)%,P0.05]和CD19+B细胞[(5.78±4.52)%vs(3.97±1.63)%,P0.05]表面ICOSL的表达均高于HC。活动期的RA患者外周血单核细胞和B细胞表面的ICOSL表达高于非活动期患者[(5.45±3.50)%vs(4.04±1.55)%,P=0.036]、[(6.59±5.74)%vs(5.63±4.30)%,P=0.016],治疗后CD4+T细胞表面ICOS的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面ICOSL的表达均显著下降[(3.33±0.31)%vs(5.56±1.11)%,P=0.076]、[(5.12±1.23)%vs(9.99±2.02)%,P=0.045]、[(3.74±0.57)%vs(8.62±1.77)%,P=0.011]。结论:RA患者外周血单个核细胞表面ICOS和ICOSL异常高表达,且与疾病活动度和临床疗效密切相关。提示ICOS/ICOSL信号通路可能参与RA免疫病理进程。     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.     

抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建

目的构建抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒，化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，各64个碱基，退火、克隆到经BglⅢ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游，获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒，转化感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆，抽取重组质粒，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组质粒经EcoRⅢ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点，经测序鉴定，序列完全一致。结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建，开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

原发性干燥综合征患者血清可溶性程序性死亡配体1的表达及临床意义

目的：检测原发性干燥综合征（primary Sjogren's syndrome, pSS）患者血清可溶性程序性死亡配体1（sPD-L1）分子的表达,并探讨其临床意义。方法收集61例pSS患者外周血标本,采用ELISA法检测pSS患者及健康对照血清sPD-L1的表达,比较13例初诊pSS患者治疗前后血清sPD-L1表达水平变化,分析其临床意义。结果与健康对照相比,pSS患者血清sPD-L1表达显著升高（0.705±0.051 ng/mL vs 0.366±0.021 ng/mL,P＜0.0001）;pSS患者血清sPD-L1表达水平与ANA滴度、RF、ESR、抗ds-DNA呈正相关（P＜0.05）;活动期的pSS患者血清sPD-L1的表达高于非活动期患者（0.788±0.086 ng/mL vs 0.559±0.042 ng/mL,P=0.022）;伴发多系统损伤pSS患者血清sPD-L1的表达显著高于单纯外分泌腺损伤患者（0.863±0.114 ng/mL vs 0.630±0.114 ng/mL,P=0.022）。治疗后sPD-L1分子的表达无显著变化。结论 pSS患者血清sPD-L1异常高表达,且与疾病活动度、组织损伤密切相关。提示sPD-L1信号可能参与pSS免疫病理进程。     

重症肌无力患者外周血CD28~-T细胞亚群变化及临床意义

检测重症肌无力(MG)患者外周血CD28-T细胞亚群的变化,并探讨其临床意义。收集46例MG患者和35例健康对照(HC)外周血标本,采用免疫荧光染色和流式细胞术检测外周血CD4+CD28-和CD8+CD28-T细胞亚群。结果显示,MG患者和HC比较,前者CD28表达下调,CD4、CD8表达无差异;MG患者CD4+CD28-T细胞亚群(13.53%±6.31%)较HC(9.24%±4.62%)异常升高(P=0.001),而CD8+CD28-T细胞亚群(39.22%±11.91%)较HC(48.41%±13.63%)显著下降(P=0.002);全身型MG(GMG)和并发胸腺异常的MG患者中,CD4+CD28-T细胞亚群比例分别较眼肌型MG(OMG)和正常胸腺MG患者升高,而CD8+CD28-T细胞亚群百分比明显下降;QMGS评分与CD4+CD28-T细胞亚群呈正相关(r=0.4113,P=0.0045),而与CD8+CD28-T细胞亚群呈负相关(r=-0.3989,P=0.0060);激素治疗后伴随CD4+CD28-T细胞比例下降(P=0.018)和CD8+CD28-T细胞比例升高(P=0.018)。本研究发现,MG患者外周血CD4+CD28-T细胞亚群比例升高和CD8+CD28-T细胞亚群比例下降与疾病严重程度、治疗反应密切相关,且在不同临床分型的MG患者中存在差异性变化。上述提示CD28-T细胞亚群的异常变化可能参与了MG的免疫病理进程。     

抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建

目的 构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒，化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，各64个碱基。退火、克隆到经BgiⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游，获得重组pSUPER-H1质粒。转化感受态大肠杆菌．挑选阳性克隆，抽取重组质粒，EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌。经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点，经测序鉴定，表明序列完全一致。结论重组pSUPER-H1载体的成功构建，为进一步研究神经生长因子活性打下基础。同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

免疫介导坏死性肌病的病因及免疫机制

正免疫介导坏死性肌病(NAM)不同于多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎及非特异性肌炎,是新近认识的一类特异性炎性肌病(IIM)~([1-2])。20世纪初人们并未认识到NAM是一种独立的肌病,将其归类于多发性肌炎、可疑多发性肌炎或皮肌炎。直到2004年,欧洲神经肌肉疾病中心和美国肌病研究协作组依据NAM的临床特点及肌肉病理表现将其单独分类~([3])。此后这一特发性炎症性肌病的新亚型逐渐得到关注,成为研     

OX40和OX40L在原发性干燥综合征患者外周血中的表达及临床意义

目的 检测原发性干燥综合征(pSS)患者外周血单个核细胞表面共刺激分子OX40和OX40L的表达,并探讨其临床意义.方法 采用免疫荧光标记流式细胞技术检测51例pSS患者及36例健康志愿者外周血T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L分子表达,比较11例初诊pSS患者治疗前后OX40和OX40L表达水平变化,分析其临床意义.结果 与健康志愿者相比,pSS患者外周血CD4+T细胞表面OX40表达显著增高(8.65％ ±3.51％ vs 5.68％ ±1.68％,P＜0.01),而CD8+T细胞表面OX40的表达无统计学差异.pSS患者表面OX40L的表达,在外周血中CD14+单核细胞(6.76％±3.60％ vs 3.15％±1.89％,P＜0.01)和CD19+B细胞(4.69％ ±2.40％ vs 2.76％ ±1.33％,P＜0.01)中均高于健康志愿者.活动期的pSS患者外周血OX40和OX40L的表达高于非活动期患者,伴发多系统损伤pSS患者外周血OX40和OX40L分子的表达显著高于单纯外分泌腺损伤患者.治疗后CD4+T细胞表面OX40的表达及CD14+单核细胞和CD19+B细胞表面OX40L的表达显著下降.结论 pSS患者外周血单个核细胞表面OX40和OX40L异常高表达,且与疾病活动度、组织损伤及治疗密切相关.     

可溶性和膜型B7-H3在类风湿关节炎患者外周血中的表达及临床意义

本实验通过检测类风湿关节炎(RA)患者外周血中可溶性B7-H3(sB7-H3)和膜型B7-H3(mB7-H3)的表达及异构体的分布,探讨该分子的异常表达在RA发病中的临床意义。通过收集RA早期患者和健康对照外周血,ELISA方法检测血清中sB7-H3的表达,统计学分析sB7-H3的表达与临床的相关性;同时分离RA患者和健康对照外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cells,PBMC),通过流式细胞术检测CD14+的单核细胞膜型B7-H3的变化;通过PCR检测外周血mRNA水平B7-H3两种异构体的表达。结果显示RA患者血清中的sB7-H3分子明显低于健康对照组,RA活动期患者sB7-H3明显低于缓解期患者,并与RA患者肿胀关节数呈负相关;RA患者外周血单核细胞上mB7-H3的表达明显高于健康对照者,RA患者PBMC在mRNA水平B7-H3明显高于健康对照者,主要表达形式为4IgB7-H3。本研究发现膜型和可溶性B7-H3在类风湿性关节炎外周血中异常表达,其可能参与了RA自身免疫性病理的调节。