基于RNA-seq的db/db小鼠大脑皮质的转录组学分析

目的通过对db/db和野生型(WT)小鼠大脑皮质组织全转录组学分析,探索参与调节2型糖尿病诱导的脑功能障碍的差异表达基因(DEGs)及相关通路和网络。方法取雄性野生型WT和db/db小鼠各9只,在第8和24周检测小鼠的体质量和血糖,之后收集动物大脑皮质进行全转录组测序(RNA-seq),并进行DEGs,GO、KEGG及蛋白互作网络分析。结果与WT组相比,db/db组大脑皮质发生变化的306个转录本中有178个表达上调,128个表达下调。DEGs中,43个上调(如Clcnka和Trim17),59个下调(如Arih1和Nectin-3)。蛋白互作网络图中的13个枢纽基因均下调,且大多属于线粒体编码家族。同时,db/db小鼠在多项GO富集类别中具有显著差异,如细胞过程、细胞部分等。此外,KEGG功能富集结果显示DEGs在代谢、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)等相关通路中高度富集,且这些富集通路中的DEGs主要影响了线粒体氧化磷酸化过程。结论揭示了2型糖尿病与中枢神经系统损伤之间的关系及潜在的相关基因、通路及网络。     

VEGF与中枢神经系统疾病的关系

VEGF是一种由缺氧诱导的血管生长相关肽,在脑内有比较丰富的表达. VEGF具有神经营养、神经保护、抗凋亡、细胞增殖、提高毛细血管渗透压等广泛的生物学作用.近年来的研究发现,VEGF与多种中枢神经系统疾病相关,如脑缺血性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病等.深入研究VEGF与中枢神经系统疾病的内在关系,研究和开发相关药物,将成为中枢神经系统疾病治疗的热点和新思路.     

靶向 CK18 的shRNA表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的： 构建靶向人角蛋白18（cytokeratin 18, CK18 ）基因的shRNA真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MCF-7细胞株,观察其对MCF-7细胞增殖的影响。 方法： 设计两条靶向 CK18基因 的RNA干扰序列,命名为CK18-shRNA1、CK18-shRNA2,同时设计阴性对照,将合成的寡核苷酸链与Psilencer3.1-H1/Hygro质粒连接形成重组质粒,并经脂质体介导稳定转染MCF-7细胞,G418筛选后扩增获得稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞株中 CK18 mRNA和蛋白的表达,并进一步通过MTT法检测重组表达载体稳定转染对细胞增殖的影响。 结果： 重组表达载体（Psilencer3.1-CK18-shRNA1、Psilencer3.1-CK18-shRNA2和Psilencer3.1-NC-shRNA）经PCR及DNA测序分析证明序列插入正确,经500 μg/ml G418筛选出稳定转染Psilencer3.1-CK18-shRNA的MCF-7细胞,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达,而Psilencer3.1-CK18-shRNA1转染不影响MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达水平。与阴性对照Psilencer3.1-NC-shRNA组相比,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞的增殖\[（0.40±0.01） vs （0.55±0.06）,P<0.05\]。 结论： 靶向 CK18 的shRNA表达载体稳定转染细胞后可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖。     

内源性组胺减轻小鼠前脑缺血再灌注后期脑损伤*

 目的： 研究内源性组胺在前脑缺血再灌注后期的神经保护作用。方法: 将野生型（WT）小鼠和组氨酸脱羧酶基因敲除（HDC-KO）小鼠各随机分为对照组和缺血组,缺血组小鼠双侧颈总动脉夹闭30 min以建立前脑缺血模型,比较再灌后WT和HDC-KO小鼠的体重变化和死亡率,并在再灌14 d时对各组存活小鼠进行条件性恐惧学习记忆测试,再灌3 d及15 d时,对各组小鼠取脑,制作冰冻切片,进行甲苯胺蓝染色,观察海马CA1区神经元损伤情况。结果: 再灌1 d后,WT和HDC-KO小鼠均出现体重下降,再灌4 d、5 d、6 d及7 d后,HDC-KO小鼠的体重恢复程度均显著低于WT小鼠。前脑缺血再灌8~14 d,HDC-KO小鼠的死亡率显著高于WT小鼠（P<0.05）。再灌14 d后,HDC-KO小鼠的背景及线索记忆能力均显著低于WT小鼠（P<0.05）。再灌3 d后,HDC-KO和WT小鼠的海马CA1区神经元密度无显著差异,而再灌15 d后,HDC-KO小鼠海马CA1区神经元密度显著低于WT小鼠（P<0.05）。结论: 内源性组胺可减轻脑缺血再灌注后期的学习记忆能力下降及神经元缺失,但其作用机制有待进一步研究。     

氯沙坦通过激活AMPK抑制LPS诱导的小鼠海马GFAP表达

目的:探讨氯沙坦对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,以及其机制是否与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。方法:将成年雄性昆明小鼠分为正常对照组、LPS模型组、氯沙坦给药组及氯沙坦与compound C合用组。侧脑室注射相同剂量LPS(24μg/d,每天1次,共2次),以建立中枢神经炎症损伤模型;氯沙坦(0.5、1或5 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前14 d开始连续每日腹腔注射给药;AMPK抑制剂Compound C(10 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前2 d开始连续每日腹腔注射给药。在LPS末次注射后的第3天取各组小鼠的海马脑区组织,利用Western blot法检测GFAP、AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR的蛋白水平。结果:2次LPS注射后可显著诱导GFAP在海马脑区的表达(P0.01),而氯沙坦可浓度依赖地抑制LPS诱导的GFAP表达,当氯沙坦剂量为5 mg·kg~(-1)·d~(-1)时可显著抑制GFAP表达(P0.05),同时,在该剂量下,氯沙坦显著提高了AMPK的磷酸化水平(P0.01),但对mTOR的磷酸化水平无明显调节作用;而AMPK抑制剂Compound C可显著逆转氯沙坦对GFAP表达及AMPK磷酸化的调节作用(P0.05)。结论:氯沙坦可抑制LPS诱导的海马GFAP表达,该作用可能与其激活AMPK有关,但并不依赖于mTOR信号通路。     

氯沙坦对小鼠前脑缺血再灌后期脑损伤的保护作用

目的研究AT1受体阻断剂氯沙坦对小鼠前脑缺血再灌后期的神经保护作用。方法将成年雄性昆明小鼠随机分为对照组、前脑缺血组、前脑缺血+氯沙坦给药组及氯沙坦单纯给药组,通过阻断双侧颈总动脉60 min建立前脑缺血模型,氯沙坦于缺血前14 d至再灌后20 d,每日腹腔注射1 mg/kg。比较再灌后不同时间点各组小鼠的体重和在水迷宫实验中的学习记忆能力差异。再灌21 d,对各组小鼠取脑、冰冻切片、进行甲苯胺蓝染色,观察海马CA1区神经元损伤情况。结果前脑缺血组小鼠再灌1 d体重即下降,再灌3 d下降程度达到最大,氯沙坦可显著提高缺血小鼠再灌3 d、7 d、14 d及21 d的体重恢复程度。再灌16 d进行水迷宫实验,前脑缺血组小鼠与对照组相比,训练第3天和第4天的平台潜伏期显著延长,而氯沙坦可显著缩短缺血小鼠的平台潜伏期。再灌21 d,前脑缺血组小鼠的海马CA1区神经元密度显著低于对照组,而氯沙坦显著抑制了神经元的缺失。结论 AT1受体阻断剂氯沙坦对小鼠前脑缺血的长期再灌注损伤具有保护作用。     

酸后处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨酸后处理,即在再灌早期给予一段短时间的酸化处理,是否对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。方法本实验采用小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型和大鼠皮质原代神经元氧糖剥夺(OGD)模型。在再灌早期不同时间点吸入含有20%CO2的混合气体(其余气体为21%O2,59%N2)5 min以降低脑内pH值或利用经20%CO2预孵育的酸化培养液对培养的神经元进行酸处理15 min。结果与MCAO手术对照组相比,再灌5 min和50 min后给予酸后处理均能明显减少再灌24 h后的脑梗死体积并降低神经症状评分,但在再灌100 min后给予酸后处理没有显著神经保护作用。相似地,在神经元OGD模型中,再灌后立即或15 min后给予酸后处理可显著提高再灌24 h的细胞存活率。进一步发现,酸后处理可显著抑制神经元OGD再灌注引起的细胞凋亡及胱天蛋白酶3表达增加。同时,与单纯MCAO组相比,给予酸后处理的小鼠缺血周边区的胱天蛋白酶3表达也明显减少。结论以上结果提示,酸后处理对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,同时,这种保护作用具有较宽的时间窗。酸后处理作为一种新的内源性保护策略对于治疗缺血性脑损伤具有潜在的临床应用价值。     

辛二酰苯胺异羟肟酸舒张大鼠离体胸主动脉作用和机制

目的研究辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对大鼠离体胸主动脉环的作用和舒张机制。方法采用离体大鼠胸主动脉环灌流,观察累积浓度SAHA(0.3、1、3、10和30μmol·L^-1)对基础状态、KCl和NE预收缩的大鼠离体胸主动脉环的作用,同时使用工具药L-NAME、Indo、PMA和SP来研究其舒张血管的可能机制,并探讨SAHA在舒张血管过程中对Ca²⁺的作用。结果SAHA能够舒张KCl和NE预收缩的大鼠离体胸主动脉(P<0.01),且对完整内皮胸主动脉作用强于去内皮胸主动脉(P<0.01),但对基础状态无明显影响;L-NAME、Indo和PMA可抑制SAHA的血管舒张作用(P<0.05),而SP能够促进其舒张血管(P<0.01);SAHA可抑制外钙内流和内钙释放而减弱CaCl 2和NE诱导的血管收缩作用(P<0.01)。结论SAHA舒张血管可能与增加内皮舒张因子NO和PGI 2生成,抑制PKC及外钙内流和内钙释放有关。     

组胺对星形胶质细胞Egr-1表达的调节作用

 目的: 探讨组胺对星形胶质细胞早期反应生长因子-1(Egr-1)表达是否具有调节作用。方法: 将野生型(WT)和组氨酸脱羧酶敲除(HDC-KO)小鼠及组胺处理的HDC-KO小鼠取脑,并提取皮层组织总RNA。将原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞分别给予不同浓度的组胺(10^-8、10^-7、10^-6、10^-5或10^-4 mol/L)处理15、30、60、120或240 min。组胺H₁、H₂受体拮抗剂分别于组胺给药前15 min加入。组胺处理完毕后,提取细胞总RNA或蛋白。利用real-time PCR和Western blot测定Egr-1的表达。结果: 与WT小鼠相比,HDC-KO小鼠大脑皮层Egr-1的mRNA表达量显著降低,而外源性给予组胺则能促进其Egr-1的mRNA表达。在培养的星形胶质细胞上,组胺可促进Egr-1的mRNA表达,其中10^-5 mol/L的组胺作用最强,而组胺(10^-5 mol/L)处理30 min时Egr-1的mRNA表达量达到峰值,相应的Egr-1蛋白表达于60 min时显著增高,该作用可被组胺H₁受体拮抗剂而非H₂受体拮抗剂显著抑制。结论: 组胺对大脑皮层组织及培养的星形胶质细胞Egr-1表达具有上调作用,该作用与激动组胺H₁受体有关。