小鼠派氏集合淋巴结T细胞活化和调节性T细胞的分析

目的： 通过对小鼠派氏集合淋巴结（PPs）、肠系膜淋巴结（MLNs）和腹股沟淋巴结（ILNs）的比较性研究，以分析PPs T细胞活化和调节性T细胞的功能特点。 方法： 无菌分离小鼠PPs、MLNs和ILNs，分别制备单个淋巴细胞悬液，运用流式细胞术结合荧光抗体染色技术来检测CD3+T细胞、CD3+CD4+辅助性T细胞和CD4+CD25＋调节性T细胞的比例；用多克隆刺激剂刀豆蛋白A（Con A）、佛波醇酯（PDB）和离子霉素（Ion） 刺激活化淋巴细胞，随后运用流式细胞术结合双色荧光抗体染色技术来检测T细胞早期活化标志CD69的表达水平。 结果： PPs内CD3+T细胞所占比例明显低于MLNs和ILNs，然而CD4+CD25＋调节性T细胞的比例明显高于MLNs和ILNs；在没有加入刺激剂的培养条件下，PPs来源的T细胞CD69的表达水平明显高于MLNs和ILNs来源的T细胞，MLNs来源的T细胞CD69的表达水平明显高于ILNs来源的T细胞；而在加入Con A或者单纯PDB的培养条件下，PPs来源的T细胞却表现出低反应性；在加入PDB＋Ion的培养条件下，3者来源的T细胞CD69的表达水平没有明显差别。 结论： PPs内CD3+T细胞所占比例较低，CD4+CD25＋调节性T细胞的比例较高，这可能是PPs整体T细胞低反应性的原因之一；PPs来源T细胞的高基础活化率可能与其不断接触小肠来源的食物和共生菌抗原有关；PPs来源T细胞选择性地对某些刺激剂表现出低反应性，提示这群细胞处于某种程度的无能状态。上述特征的生物学意义在于避免因为不断接受小肠来源的食物和共生菌抗原的刺激而发生病理性炎症的同时还保留对病原微生物抗原的应答。     

雌激素处理DCs在诱导小鼠同种皮肤移植免疫耐受中的作用

目的：研究雌二醇（17β-estradiol, E₂）处理的供体骨髓来源树突细胞（dendritic cells, DCs）在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的作用。方法：体外培养小鼠骨髓来源DCs，然后用E₂处理。受体小鼠在皮肤移植前经尾静脉分别输注经E₂处理的供体小鼠DCs、供体小鼠成熟DCs以及不成熟DCs，输注PBS为对照组。1周后对受体小鼠进行同种异基因皮肤移植，手术后观察皮肤存活情况，应用流式细胞术检测手术前后受体小鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞百分率的变化。结果：在同种异基因皮肤移植中，受体小鼠尾静脉输注经E2处理的DCs组与对照组和不成熟DCs组比较，移植皮肤存活时间显著延长，较不成熟DCs组存活时间平均延长10.6 d（P<0.01）；与对照组和不成熟DCs组比较，E₂处理组外周血中CD4+CD25+ 调节性T细胞百分率明显升高（P<0.01）。结论：在同种异基因小鼠皮肤移植模型中，E₂处理的供体小鼠DCs可以延长移植皮肤存活时间。     

槲皮素对小鼠T细胞体外活化的抑制作用

目的:通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD69表达的影响,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法:分离小鼠淋巴结细胞,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养,分别于2、6、24h收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞仪对T细胞的CD69分子表达情况进行分析并计算抑制率。结果:槲皮素(终浓度10μmol/L)对未受刺激的T细胞CD69表达百分率无明显影响,而经佛波醇酯(PDB)及刀豆蛋白A(ConA)活化同时加入槲皮素的T细胞CD69表达百分率在2h、6h及24h均显著下降(P＜0.01)。槲皮素对PDB的抑制率随作用时间延长而明显下降,对ConA的抑制率平缓而持久。结论:槲皮素对PDB、ConA活化的T淋巴细胞均显示明显的抑制效应,表明该药可能作用于T细胞活化信号传递通路蛋白激酶Cθ或其下游部位,并且,这种抑制效应表现出一定的可逆性。     

喘可治注射液抑制小鼠变应性接触性皮炎的实验研究

目的：探讨中药喘可治注射液抑制小鼠变应性接触性皮炎（Ⅳ型变态反应）的效果。 方法： 将小鼠按给药不同分为喘可治注射液高、中，低剂量组，地塞米松(DEX)组，苯海拉明及生理盐水组，利用2，4-二硝基氟苯诱发的小鼠左耳变应性接触性皮炎的动物模型，各组于第0 d、1 d致敏前2 h，第2 d和第5 d诱发前2 h及诱发后6 h腹腔注射给药，通过测量左耳厚度差、左耳重量差，体重差及观察左耳病理改变，比较不同剂量喘可治注射液之间以及与对照组之间的疗效。 结果： 喘可治注射液高、中、低剂量和DEX组小鼠左耳厚度及重量的增加，浸润的单核细胞和中性粒细胞的数量均明显低于生理盐水组(P<0.01)；DEX组小鼠左耳红肿的程度虽稍低于喘可治组，但小鼠体重差与其它组比较均有显著差异（P<0.01）；苯海拉明组小鼠变应性接触性皮炎的程度与生理盐水组差异无显著。 结论： 喘可治注射液具有明显抑制小鼠变应性接触性皮炎的作用。     

人外周血T细胞活化状态对血卟啉单甲醚吸收的影响

目的：观察健康人外周血T细胞的活化状态对其吸收新型光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)的影响。以期为进一步研究HMME-PDT对活化T细胞选择性作用提供实验依据。 方法： 以流式细胞仪检测孵育浓度和孵育时间对活化T细胞吸收HMME的影响。密度梯度法常规分离人外周血淋巴细胞，分别以多克隆刺激剂PHA和PDB+Ion刺激T细胞活化，同时设立未加刺激剂的静止T细胞作对照。在评价孵育浓度对T细胞吸收HMME的影响时，将上述处理的淋巴细胞分别与0、5、10、20、30和40 mg/L的HMME孵育1 h，经CD3抗体染色后进行T细胞HMME吸收分析。在评价T细胞活化状态对HMME吸收量与孵育时间相关性的影响时，将培养的淋巴细胞与10 mg/L的HMME分别孵育0-160 min后进行检测。 结果： T细胞的活化使其HMME吸收量的孵育浓度相关曲线以及孵育时间相关曲线较静止T细胞右移和上移。在一定孵育浓度范围内(5-20 mg/L)，活化T细胞对HMME的吸收量明显大于静止T细胞，差别具有统计学意义。然而，随着孵育浓度的进一步增加，活化T细胞与静止T细胞对HMME吸收量的差异逐渐减小。在10 mg/L HMME孵育浓度的条件下，不论活化与否，随着孵育时间的延长，T细胞内HMME的吸收量在逐渐增强。在15-60 min之间，活化T细胞HMME吸收量明显高于静止T细胞。 结论： 活化T细胞与静止T细胞HMME吸收量的差别取决于其孵育浓度和孵育时间，在一定孵育浓度和孵育时间范围内，活化T细胞HMME的吸收量明显高于静止T细胞，提示这可能有助于形成选择性删除活化T细胞的剂量关联和时间关联的HMME-PDT治疗窗口。     

雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化的抑制作用

目的:研究雷公藤甲素(TRD)对小鼠T淋巴细胞活化标志CD69、CD25及细胞因子IL-2及IFN-γmRNA表达的影响,为阐明其免疫抑制作用提供分子药理学依据.方法:无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的雷公藤甲素预先孵育1 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆体双染技术,流式细胞仪检测TRD对小鼠T细胞CD69、CD25表达的影响;采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测TRD对细胞因子IL-2、IFN-γ mRNA的表达的影响.结果:TRD能抑制T细胞早期活化标志CD69和CD25,同时TRD也能抑制IL-2及IFN-γmRNA的表达.结论:TRD对T细胞早期活化分子及细胞因子表达的抑制作用可能是其发挥免疫抑制作用的机制之一.     

实时定量PCR检测小鼠成熟过程中T淋巴细胞sjTRECs水平

目的:实时定量PCR检测正常小鼠成熟过程中胸腺及脾脏T淋巴细胞的信号结合T细胞受体重排删除DNA环(sjTRECs)含量,从而推测T淋巴细胞中的初始T细胞的数目,评价小鼠成熟过程中的胸腺功能.为胸腺发育和功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法.方法:实时定量PCR(SYBR Green法)检测T淋巴细胞中sjTRECs含量.结果:1～6 wk的小鼠胸腺中的初始T细胞含量持续增加,9wk时已经开始下降,12 wk时持续下降.而小鼠的外周中初始T细胞的含量则随着周龄增加而增加(1～12wk).结论:在小鼠的成熟过程中,从9wk开始胸腺的生成功能减弱,而胸腺的输出功能持续增加;成功建立和应用实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量,是准确评价小鼠胸腺功能的方法.     

根皮素对小鼠T淋巴细胞体外活化、周期、Ca~(2+)离子内流以及凋亡的影响

目的:研究根皮素(Ph)对小鼠T淋巴细胞中期活化、细胞周期、Ca~(2+)离子内流以及凋亡的影响,探讨将其发展为免疫干预药物的可能性.方法:双色荧光抗体染色结合流式细胞术(FCM)分析Ph对多克隆刺激剂(ConA)刺激下的小鼠T淋巴细胞CD25表达的影响;PI染色法检测Ph对T淋巴细胞周期的影响;Fluo-4/AM染色结合FCM分析Ph对T淋巴细胞Ca~(2+)离子内流的影响;calcein/Co~(2+)技术检测Ph对T淋巴细胞线粒体通透性转换(MPT)的影响,并用DIOC_6(3)染色检测其对线粒体膜电势(MMP)的影响.结果:Ph(40,60,80 μmol/L)对ConA刺激的T淋巴细胞CD25表达有显著的抑制作用(P＜0.01＝;Ph能抑制T淋巴细胞Ca~(2+)离子内流(P＜0.01＝;细胞周期分析显示,Ph能将T淋巴细胞抑制在S期;且Ph能够诱导和加速MPT,并导致MMP的显著下降.结论:Ph对小鼠T淋巴细胞活化和Ca~(2+)内流具有显著的抑制作用,并能将细胞抑制在S期,能通过线粒体途径诱导T淋巴细胞凋亡,可望发展成为一种新的免疫抑制药物.     

增强型绿色荧光蛋白在人软骨细胞中的表达及修复重建人软骨示踪方法的研究

目的:检测增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)基因在原代培养的人鼻中隔软骨细胞的转染效率及瞬时表达,建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法,为用组织工程法修复重建人软骨寻求示踪方法提供依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率。结果:增强型绿色荧光蛋白在基因转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其转化率为35.37%,且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人软骨细胞仍能在体外存活,pEGFP-N1是转染原代培养的人软骨细胞较为理想的瞬时表达载体,也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

CD4+、CD8+、CD25+、CD69+淋巴细胞在种间、同种胚胎植入期母体及同期假孕小鼠淋巴结中的差异

目的：研究种间胚胎植入期母体淋巴结中表达CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋、CD69＋T细胞的百分比变化,并探讨这种变化对种间胚胎植入的影响。方法：利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测种间、同种胚胎移植以及同时期假孕母体淋巴结中表达CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋、CD69＋的T淋巴细胞对应CD3^＋细胞的百分率。结果：与同种胚胎移植后的植入相比,种间胚胎移植后植入期母体淋巴结中,CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD25^＋淋巴细胞占CD3^＋淋巴细胞的比例均极显著低于同种胚胎移植的植入期受体（P〈0.01）;而CD3^＋CD8^＋淋巴细胞占CD3^＋淋巴细胞的比例显著低于同种胚胎移植的植入期受体（P〈0.05）;CD3^＋CD69＋淋巴细胞在种间、同种胚胎植入期母体淋巴结中的比例却无显著差异（P〉0.05）。种间胚胎植入时母体淋巴结中CD4^＋/CD8^＋的比例,与同种胚胎植入受体和假孕小鼠相比,三者之间均无统计学意义上的显著差异（P〉0.05）。结论：种间胚胎移植后从植入期开始,母体淋巴结中的淋巴细胞就发生了不利于胚胎植入的全身免疫反应。