马兜铃酸诱导大鼠肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积及垂盆草提取物的作用

 目的：研究垂盆草（SSB）提取物对马兜铃酸（AA）诱导的肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积的作用,并初步探讨可能的分子机制。方法：将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）分为：(1) 溶剂对照组：未加入SSB和AA;(2) AA损伤组：只加AA,浓度为1~100 mg/L;(3) SSB提取物干预组：在加入10 mg/L AA基础上,同时加入SSB提取物（10~2 000 mg/L）。细胞培养24 h后,酶联免疫吸附试验检测转化生长因子β1(TGF-β1)含量;细胞免疫荧光染色检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮细胞标志物E-cadherin和基质成分III型胶原的表达;实时荧光定量PCR检测α-SMA、E-cadherin、骨形成蛋白7（BMP-7）和I型胶原mRNA的表达。结果：AA可诱导NRK-52E细胞呈现纤维化样改变;1 mg/L和10 mg/L AA不仅可增加基质成分I型和III型胶原的表达量,同时也可促进α-SMA表达,抑制E-cadherin的表达。用SSB提取物干预后,AA所致的纤维化改变明显减轻;SSB提取物下调了α-SMA、I型和III型胶原的表达,并且促进E-cadherin和BMP-7的表达。此外,SSB提取物也抑制TGF-β1的分泌,并呈浓度依赖性。结论：应用SSB提取物干预可明显降低AA所致的肾纤维化效应,可能的机制为SSB提取物降低TGF-β1的表达,抑制小管上皮细胞的表型转化,进而抑制胶原的累积。     

IRF3调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞外基质表达的研究

目的通过观察干扰素调节因子3（IRF3）对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞外基质表达的作用,探讨IRF3在皮肤纤维化中的调控机制。方法取行瘢痕疙瘩切除手术的10例患者的术中切除的瘢痕疙瘩组织为研究材料,另择8例外科手术患者的正常皮肤组织为对照,培养两者的成纤维细胞。采用real-timeRT-PCR、Westernblot检测成纤维细胞IRF3mRNA、蛋白表达水平,转染siRNAs-IRF3后IRF3蛋白水平;检测TGF-茁1诱导后瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖情况,细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）、a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）I型胶原与TGF-茁受体Ⅰ、Ⅱ,及TGF-茁1信号通路调节蛋白p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3表达水平。结果IRF3在瘢痕疙瘩组织中表达显著上调。下调IRF3的表达,显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并抑制collagenⅠ、a-SMA的表达,同时抑制TGF-茁1诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞的TGF-茁受体Ⅰ、Ⅱ的表达。下调IRF3的表达亦抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3表达水平。结论IRF3表达下调通过抑制TGF-茁1/Smad信号通路,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞外基质的表达。IRF3或为治疗瘢痕疙瘩新的靶点。     

输尿管梗阻及再通大鼠肾组织中单核-巨噬细胞相关因子动态表达

目的 探讨输尿管梗阻及再通大鼠肾间质纤维化发生和恢复过程中单核-巨噬细胞相关因子的动态表达。方法 将48只SD大鼠随机分成梗阻和再通两个实验部分,梗阻部分分为假手术组（sham,n=6）、单侧输尿管梗阻（UUO）3d（n=6）、UUO 7d（n=6）和UUO 14d（n=6）;再通部分分为双侧输尿管梗阻（RBUO）0d（n=6）、RBUO后再通3d（n=6）、RBUO后再通 7d（n=6）和RBUO 后再通14d（n=6）。术后3、7和14 d后处死取其肾脏组织。采用HE和Masson染色观察肾组织病理改变和间质纤维化程度;免疫组织化学染色检测肾组织内单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞克隆刺激因子（M-CSF）和活化巨噬细胞标志物CD68的表达水平;Real-time PCR检测MCP-1和M-CSF mRNA表达水平;ELISA测定TGF-β1含量。 结果 与Sham大鼠相比,UUO大鼠随着梗阻时间延长,纤维化程度加剧。同时TGF-β1水平明显升高。输尿管再通后,纤维化程度随时间延长明显减轻,且TGF-β1水平明显下调。UUO大鼠肾组织中,MCP-1和M-CSF mRNA和表达蛋白随梗阻时间延长而增加;梗阻再通后,MCP-1和M-CSF mRNA和蛋白表达随再通时间延长持续下降。MCP-1和M-CSF在UUO或再通大鼠肾组织中的表达与CD68呈现一致性变化趋势。 结论 输尿管梗阻后,M-CSF和MCP-1的动态表达反映单核-巨噬细胞的活化和聚集状态,这可能是间质纤维化发生十分重要的炎症基础。而输尿管再通可抑制活化和趋化的单核-巨噬细胞,控制炎症反应,缓解肾间质纤维化。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞数量与肝脏疾病慢性化进展关系的研究

目的探讨慢性乙型肝炎患者(chornic hepatitis B,CHB)外周血中CD4+CD 25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的数量与肝脏慢性疾病进展的关系。方法流式细胞术检测抗病毒治疗后45例CHB患者(根据B超将其分为3组,其中B超提示肝脏无异常改变的单纯CHB组15例,提示慢性肝病改变的CHB慢性肝病组15例,提示肝硬化改变的CHB肝硬化组15例)与B超均提示肝脏无异常改变的15例慢性乙型肝炎病毒携带者(asymptomic HBV carriers,ASCs)以及15例健康成年人(normal control,NC)对照外周血中CD4+CD25+Treg的变化,并分析Treg与患者年龄,HBeAg定量,ALT、AST、TGF-β1水平的相关性。结果外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+淋巴细胞的比例在抗病毒治疗后单纯CHB组为(4.03±1.36)%,与NC组(4.02±1.14)%相比差异无显著性(t=0.0223,P>0.05),与ASCs组(5.26±1.25)%相比显著减少(t=-2.2872,P<0.05);CHB慢性肝病组为(5.65±2.01)%,CHB肝硬化组为(5.32±1.47)%,与NC组、单纯CHB组比显著增高(t值分别为3.0351、3.0129、2.4269、2.4046,均P<0.05)与ASCs组相比差异无显著性(t值分别为0.7257、0.1174,均P>0.05);CHB慢性肝病、肝硬化组间相比差异无显著性(t=0.6083,P>0.05)。Treg的数量与年龄、AST、TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.327、0.324、0.306,P分别为0.004、0.005、0.008)。结论 Treg在低水平AST时CHB患者外周血中的数量的增高对抗病毒治疗后的CHB患者更能反映其肝脏慢性损伤程度,Treg可能参与了慢性HBV感染后肝脏疾病慢性化进展的过程。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞数量与肝脏疾病慢性化进展关系的研究

目的探讨慢性乙型肝炎患者（chornichepatitis B,CHB）外周血中CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory Tcells,Treg）的数量与肝脏慢性疾病进展的关系。方法流式细胞术检测抗病毒治疗后45例CHB患者（根据B超将其分为3组,其中B超提示肝脏无异常改变的单纯CHB组15例,提示慢性肝病改变的CHB慢性肝病组15例,提示肝硬化改变的CHB肝硬化组15例）与B超均提示肝脏无异常改变的15例慢性乙型肝炎病毒携带者（asymptomic HBV carriers,ASCs）以及15例健康成年人（normal control,NC）对照外周血中CD4＋CD25＋ Treg的变化,并分析Treg与患者年龄,HBeAg定量,ALT、AST、TGF—β水平的相关性。结果外周血中CD4＋CD25＋Treg占CD4＋淋巴细胞的比例在抗病毒治疗后单纯CHB组为（4．03±1．36）％,与NC组（4．02±1．14）％相比差异尤显著性（t=0．0223,P〉0．05）,与ASCs组（5．26±1．25）％相比显著减少（t=-2．2872,P〈0．05）;CHB慢性肝病组为（5．65±2．01）％,CHB肝硬化组为（5．32±1．47）％,与NC组、单纯CHB组比显著增高（t值分别为3．0351、3．0129、2．4269、2．4046,均P〈0．05）与ASCs组相比差异无显著性（￡值分别为0．7257、0．1174,均P〉0．05）;CHB慢性肝病、肝硬化组间相比差异无显著性（t=0．6083,P〉0．05）。Treg的数量与年龄、AST、TGF—β1水平呈正相关（r分别为0．327、0．324、0．306,P分别为0．004、0．005、0．008）。结论Treg在低水平AST时CHB患者外周血中的数量的增高对抗病毒治疗后的CHB患者更能反映其肝脏慢性损伤程度,Treg可能参与了慢性HBV感染后肝脏疾病慢性化进展的过程。     

Sonic hedgehog信号通路在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达变化及意义

 目的：探讨Sonic hedgehog（Shh）信号通路在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织中的表达变化及意义。方法：将48只SD大鼠随机分为UUO模型组（n=24）和假手术组（n=24）,梗阻术3、7和14 d后取其梗阻侧肾脏组织。用HE和Masson染色检测肾间质纤维化程度,免疫组织化学染色检测Shh通路分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1及III型胶原的蛋白表达,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测肾组织中TGF-β₁和Shh含量,real-time RT-PCR检测TGF-β₁、I和III型胶原及Shh通路分子mRNA表达。结果：HE和Masson染色显示,梗阻侧肾组织出现明显的纤维化病变,且随时间延长而加剧。TGF-β₁、I和III型胶原含量在梗阻肾中表达明显增高（P<0.05）。同时,Shh信号通路分子Shh、Smo和Gli mRNA和蛋白在梗阻肾中表达明显升高（P<0.05）,而Ptch1 mRNA和蛋白的表达下调（P<0.01）,提示Shh信号被激活。相关分析表明,Shh信号起始信号Shh水平的升高与TGF-β₁含量增加呈明显的相关。结论：UUO大鼠诱导肾间质纤维化发生过程中,Shh信号通路分子被激活,推测可能的机制是活化的Shh信号通路诱导TGF-β₁表达和释放,导致肾间质纤维化。     

M1/M2型巨噬细胞极化参与肾组织炎症损伤和修复进程

目的:研究M1/M2型巨噬细胞在肾组织炎症损伤和修复进程中的分布趋势及作用。方法:将45只雄性SD大鼠随机分为缺血再灌注损伤(IRI)组和单侧输尿管梗阻(UUO)组两部分。IRI组分为假手术(sham)组及术后0、6、24和72 h组;UUO组分为sham组及梗阻3、7和14 d组;每个时相5只大鼠。全自动生化分析仪检测血肌酐和尿素氮水平;HE与免疫组织化学染色分别观察肾组织损伤及CD68的表达;流式细胞术检测M1(CD68+、F4/80+和CD16/32+)和M2(CD68+、F4/80+和CD206+)型巨噬细胞的分布;ELISA检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:IRI早期,肾组织损伤程度随再灌时间延长而加剧,并与CD68+巨噬细胞浸润呈一致性变化趋势;至24 h,组织损伤与巨噬细胞浸润最为严重;但之后随时间延长,损伤和巨噬细胞浸润反而减轻。UUO组中,肾损伤随梗阻时间延长而加剧,14d时纤维化明显;而巨噬细胞浸润第7天最为严重,之后又有减轻。流式细胞术分析显示IRI和UUO损伤早期浸润的巨噬细胞以M1型为主,i NOS表达较高;IRI和UUO损伤后期巨噬细胞均向M2型极化,Arg-1水平明显增加;巨噬细胞这种变化趋势与肾组织在不同时间节点出现损伤与修复表征存在明显相关性。深入分析发现,M1型巨噬细胞可通过诱导TNF-α高表达促进早期炎症损伤,M2型巨噬细胞通过提高TGF-β1水平促进后期纤维增生性修复。结论:UUO和IRI过程中均存在巨噬细胞极化:M1型巨噬细胞可诱导早期损伤,M2型巨噬细胞则参与损伤后期的纤维性修复。M1和M2型巨噬细胞在损伤修复过程中的极化特征可为临床治疗提供指导。     

小G蛋白Rac1在马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用及意义

目的：探讨马兜铃酸（从）致肾小管上皮细胞损伤的机制及小G蛋白Racl在此过程中发挥的作用。方法：以溶剂作为对照组,从以浓度10μg／mL作用于大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,培养24h后,WST-1法检测细胞增殖的抑制率;Hoechst33258染色观察细胞核的形态变化;细胞免疫荧光染色检测Ⅲ型胶原和Racl蛋白的表达;real—time RT—PCR检测TGF—D1mRNA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中Racl和TGF—β1含量,并分析两者相关性。结果：从可明显抑制NRK-52E细胞增殖,并诱导细胞凋亡。从以10μg／mL处理NRK-52E细胞24h后,TGF—β1 mRNA的表达明显升高（p〈0．05）,并且细胞外基质成分Ⅲ型胶原的表达明显增加（P〈0．05）。此外,从也可诱导小G蛋白Racl的表达（P〈0．05）。相关分析显示,AA诱导NRK-52E细胞损伤过程中,Racl的表达量与TGF—β1的分泌水平呈现明显正相关（r=0．967,P〈0．01）。结论：从诱导肾小管上皮细胞出现纤维化样改变,同时伴有Racl蛋白的高表达;Racl及其介导的信号通路可能被TGF-β1的高表达所活化,进而参与从所致的胶原累积过程。     

miR-222通过MMP1对增生性瘢痕成纤维细胞的调控机制研究

目的观察成纤维胶原酶1（MMP1）和miR-222在增生性瘢痕（HS）成纤维细胞中的表达水平,探讨miR-222对HS发生、发展的调控机制。方法选取36例HS患者的HS组织,并各留取HS旁正常组织作为对照。分离培养出HS组织与正常组织的成纤维细胞;采用RT-PCR法检测成纤维细胞MMP1mRNA和miR-222表达水平;采用Westernblot法检测成纤维细胞MMP1蛋白表达水平;采用MTT法检测成纤维细胞增殖情况;采用双荧光素酶报告实验检测miR-222是否可调控MMP1基因。结果与正常组织比较,HS组织成纤维细胞MMP1mRNA、蛋白表达水平均下调（均P＜0.05）,miR-222表达水平上调（P＜0.05）。与空白对照成纤维细胞比较,HS组织转染MMP1过表达质粒后的成纤维细胞MMP1mRNA、蛋白表达水平均上调（均P＜0.05）,增殖速度明显减慢（P＜0.05）;转染antagomiR-222质粒后的成纤维细胞miR-222表达水平下调（P＜0.05）,MMP1mRNA表达水平上调（P＜0.05）,增殖速度明显减慢（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果表明miR-222能与MMP1基因的3′-UTR区相结合,从而调控其表达。结论miR-222在HS组织中存在过表达,miR-222或通过负调控其靶基因MMP1的表达而发挥其调控成纤维细胞增殖和凋亡的作用。     

结直肠癌患者血浆中miR-221的临床价值

目的:探究结直肠癌(CRC)患者血浆中miR-221的临床价值。方法:收集60例正常健康体检志愿者(对照组),80例就诊我院的CRC患者(病例组),对所有入选者均进行血浆miR-221实时荧光定量聚合酶链反应(real time-PCR)检测。结果:(1)血浆miR-221含量在CRC组织较对照组表达明显升高(P<0.001),并随着duke分期的发展呈现递增的趋势(P<0.01)。(2)患者入院后均符合手术治疗条件,并于术后第7天复查miR-221含量,发现较治疗前明显减低(P<0.01)。3.对入院时CRC患者根据血浆miR-221相对值进行分组,miR-221高值组术后2年内发生癌复发的发生率高于低值组(P<0.001)。结论:血浆miR-221的测定有助于CRC的诊断,并对病情的估计和预后的判断有一定的帮助。