HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达 ,其表达产物具有良好的特异性及活性     

用RACE技术对一株肠道病毒3''端进行扩增和序列分析

目的 应用3′RACE技术对一株本室分离肠道病毒基因组3′末端进行扩增，并对其核苷酸序列进行比较分析。方法 提取病毒总RNA，以锚定oligdT（17）引物进行逆转录，用特异引物及锚定引物进行3′RACE扩增，将PCR产物进行克隆、测序和序列分析。结果 获得了该病毒的3′端核苷酸序列，同源性分析结果显示该肠道病毒的核苷酸序列与肠道病毒76、89、90、91型的同源性最高为90％左右，而与其他型别的肠道病毒的同源性均小于80％；推导的氨基酸同源性与肠道病毒76、89、90、91型均在90％以上。结论 用RACE技术对肠道病毒3′端进行扩增及序列分析，证明该病毒属新型肠道病毒类，为进一步研究该病毒的分子生物学特性奠定了基础。     

HIV多抗原位点串联基因的表达及活性鉴定

目的在原核表达载体系统中对HIV—1／2型外壳蛋白多个抗原位点串联基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法人工合成含HIVgp41的2个抗原位点、gp120的3个群的各3个抗原位点及gp36的2个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，利用固化金属离子配体亲和层析技术纯化表达蛋白．利用逐渐降低尿素浓度透析法使目的蛋白复性。用免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一条约32KD的蛋白带．与设计分子量相符。免疫印迹、ELISA试验显示该表达蛋白可与HIV患者血清较好结合．而与其它患者血清无交叉反应。结论成功构建了由HIV外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经一步纯化后纯度较高．并具有良好特异性和活性。     

急性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒序列的研究

目的:研究急性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒序列。方法:提取急性乙型肝炎患者血清中HBV DNA,扩增其表面抗原序列,测序并相互比较。结果:测定5例急性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒均为adw亚型,其中3例同源性>99%。结论:adw亚型HBV感染后较多为急性病变,由于病毒变异少,机体有可能清除HBV。     

γ-球蛋白及胆碱酯酶与肝组织病理损害的关系

目的研究血清γ球蛋白（γG）及胆碱酯酶与肝组织病理损害的关系．方法采用醋酸纤维薄膜法测定135例经病理证实的慢性肝炎，肝炎肝硬变及重型肝炎的血清γG；同时采用酶速率法测定他们的血清胆碱酯酶（SChE）活力结果随着肝组织纤维化程度和（或）炎症程度的加重，血清γG逐渐升高，而SChE活力则逐渐下降，差异非常显著（P＜0．01）；γG与ChE活力的相关系数为-0．612．结论血清γG的水平能准确地反映肝脏的病理损害；SChE活力能很好地反映肝脏的合成功能，肝脏的储备功能，亦能准确地反映肝脏的病理损害．     

甲型H1N1流感患者血清流感病毒血凝抑制抗体滴度变化分析

目的 了解甲型H1N1流感患者发病后体内流感病毒特异性血凝抑制抗体滴度变化.方法 采集28例甲型H1N1流感患者发病后不同时间的血清,采用血凝抑制试验测定其抗体滴度并分析.结果 患者距发病1、5、15、22、37、49天和58天的血凝抑制抗体滴度分别为5.36、9.39、39.02、57.99、137.92、55.19和57.99,患者的最高抗体滴度几何均数为148.55,其中96.4％( 27/28)的患者在病程中产生保护性抗体和发生抗体血清转换.结论 甲型H1N1流感患者能有效产生保护性水平的抗体,有较好的免疫反应.     

1株新型肠道病毒的生物学特性鉴定

目的从1例急性肝炎患儿粪便标本中分离到1株新型肠道病毒,鉴定其生物学特性。方法采用细胞培养、动物试验、中和试验、电子显微镜观察和分子生物学等技术进行鉴定。结果该病毒对乙醚不敏感,在pH3．0及37℃ 60min条件下稳定,56℃30min可以被灭活;能在A549和RD细胞中稳定传代,并致细胞病变;不能被已有肠道病毒免疫血清中和;小白鼠乳鼠对该病毒不敏感;电子显徽镜下可见27-30nm的肠道病毒样颗粒;部分核苷酸序列分析表明,病毒VPI区核苷酸序列与肠道病毒89型的同源性为87％。与其他病毒无有意义的同源性。结论该病毒的生物学特性与肠道病毒相似,但其抗原性和核苷酸序列等与已知肠道病毒有较大差异,可能属于肠道病毒89型的1个新亚型。     

新型肠道病毒89型结构蛋白VP1的构建表达及序列分析

目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白．并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH—VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性。将EV89VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树。结果重组质粒在1mmol／L的IPTG37℃诱导7h后可诱导表达得到约33kD的蛋白。经WesternBlot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性。分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与Genbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86．4％、85．9％、85．6％。结论成功构建EV89重组蛋白．其表达产物具有良好的特异性及活性,可进-步用于VP1检测方法的研制。进化分析表明,分离的EV89VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远。     

突变型HBV前C-C基因疫苗的构建及真核细胞表达

目的采用点突变技术对HBV前C—C基因中的蛋白酶切位点进行4处点突变,构建突变型HBV前C—C／ENHⅡ重组基因疫苗,转染HepG2细胞,研究其存真核细胞内的表达情况。方法采用单引物二次PCR法对质粒VEC依次进行基因点突变,得到151＋154（VE2）、151＋154＋164＋167点突变（VE4）2种突变型疫苗,转染HepG2细胞,通过细胞免疫化学、酶联免疫分析、免疫印迹等方法检测其在HepG2细胞内的表达情况及表达产物的分子量。结果VEC、VE2、VE4转染HepG2细胞均胞浆表达目的蛋白,产物分子量分别为18、20、22kD,细胞裂解液的HBeAg含量VE4、VE2高于VEC,上清中则反之。结诊安蛮刭HRV前C—C基因疫苗VE2、VE4构建成功并表达预期病毒前C蛋白前体。