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1.
ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体(mAb).方法:克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6-His标签.纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果:成功表达了ERCC1蛋白.SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为37 000.获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株(6F8), 其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b.ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶ 1.5×106.Western blot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性.结论:成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb. 相似文献
2.
目的:探讨Tie2介导的基因导入系统体内靶向转导p53基因治疗肺癌的效果。方法:应用双功能交联剂SMCC将Tie2配体寡肽GA3与PEI连接构建靶向Tie2的基因载体。体外试验将GA3-PEI/luciferase导入Tie2表达阳性的SPC-A1肺癌细胞与Tie2表达阴性的SMMC7721肝癌细胞中,24 h后检测luciferase活性。体内导入试验将GA3-PEI/β-gal复合物注射SPC-A1细胞裸鼠种植瘤周围皮下,同时设立PEI/β-gal组为对照;24 h后牺牲裸鼠,检测心、肝、脾、肺、肾和瘤体的β-gal表达。另外将另一批四周龄SPC-A1肺癌种植瘤裸鼠随机分为5组:(1)NS;(2)GA3;(3)p53;(4)PEI/p53;(5)GA3-PEI/p53;每组6只;皮下注射GA3-PEI/p53基因复合物,隔2天1次,并测量肿瘤长短径,计算瘤体积及抑瘤率。结果:GA3-PEI/luciferase组的luciferase活性在SPC-A1细胞中明显高于SMMC7721细胞(P〈0.05)。在种植瘤中可见较多蓝染细胞,心、肝、脾、肾组织中几乎不见篮染,肺支气管黏膜除外。与对照组比较,GA3-PEI/p53治疗组对肿瘤生长有明显抑制作用(P〈0.05),其抑瘤率为61.29%。结论:GA3基因导入系统靶向转导p53基因,显著抑制肿瘤生长。 相似文献
3.
目的:探讨酪氨酸蛋白激酶受体EphA2在人脑胶质瘤中的表达及其与胶质瘤微血管生成之间的相关性。方法:用免疫组化方法检测66例人脑胶质瘤组织,2株成胶质细胞瘤细胞系(U251和U87)和10例正常脑组织中EphA2蛋白的表达情况。并用Western blot方法进一步验证高级别成胶质细胞瘤组织和正常脑组织中EphA2的表达情况。通过CD34免疫组化染色方法来计算胶质瘤组织中的微血管数(MVC),探讨EphA2的表达水平与胶质瘤的微血管生成之间可能存在的关系。结果:免疫组化结果表明:在所有检测的66例胶质瘤中,除3例低级别胶质瘤(Ⅰ~Ⅱ)未检测到EphA2表达外,其余均有不同程度的EphA2表达,阳性率为95.5%(63/66);而10例正常脑组织中EphA2蛋白表达均为阴性,二者差异显著(P〈0.01)。并且高级别脑胶质瘤(Ⅲ~Ⅳ)中EphA2强阳性表达率为63%(29/46),明显高于低级别胶质瘤30%(6/20)的阳性表达率,二者差异显著(P〈0.01)。此外,肿瘤组织内微血管内皮细胞也有EphA2蛋白表达。Westernblot结果也进一步证实了成胶质细胞瘤组织和细胞系U251高表达EphA2蛋白,且U87表达水平明显低于U251,正常脑组织中检测不到EphA2蛋白条带。胶质瘤的微血管密度与EphA2蛋白表达水平有显著相关性(r=0.713,P〈0.01),EphA2表达强阳性的肿瘤区域有较高的微血管密度。结论:EphA2特异地表达于高级别胶质瘤中,而正常脑组织中则检测不到EphA2表达,提示EphA2有可能是恶性胶质瘤的一个新的标志物,或可作为分子治疗的靶点,并且EphA2可能参与胶质瘤的血管生成,在胶质瘤的发病和恶性进展中起重要作用。 相似文献
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酪氨酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1在23种肿瘤细胞系中的表达及其意义 总被引:4,自引:0,他引:4
背景与目的:酪氯酸蛋白激酶受体EphA2及其配体EFNA1可能在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。本研究探讨EphA2/EFNA1在不同肿瘤细胞中的表达及其意义。方法:用RT-PCR方法,检测了23种人类肿瘤细胞系中EphA2/EFNA1在mRNA水平上的表达,、并用Western blot方法检测了EphA2蛋白在不同肿瘤细胞系中的表达水平。结果:RT—PCR结果显示.除白血病细胞K562和HL60,以及视网膜母细胞瘤RB几乎检测不到EphA2/EFNA1外.EphA2/EFNA1高表达于肝癌、肺癌、卵巢癌、官颈癌、前列腺癌、胃腺癌、脑胶质瘤、膀胱癌、成骨肉瘤及恶性黑色素瘤等20种细胞系中。Western blot结果显示,除K562外,EphA2蛋白在不同肿瘤细胞系中均有表达。结论:EphA2/EFNA1高表达于人类多种肿瘤细胞中,并且EFNA1的表达水平相对低于EphA2的表达、EphA2./EFNA1可作为一个较为广潜的肿瘤标记,并有可能成为肿瘤治疗的靶点。 相似文献
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前言 二十世纪的八○年代,将在人类医学史上留下一个难以磨灭的烙痕,因为号称“二十世纪黑死病”的爱滋病(AIDS)就在八○年代的初期,悄悄的在全世界散布开来,这个神秘的疾病,不但震惊了医学界,也吓坏了全世界,可以说到了“人人自危”的地步。很幸运地,在短短的几年内,这个神秘疾病的面纱,逐渐的被揭开了,它的罪魁祸首——反转录病毒(retrovi 相似文献
6.
稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆。选取高表达EG-FRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性。结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex。用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10-5。Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFR-vⅢex特异结合。结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达,以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清。 相似文献
7.
目的: 制备靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)隐蔽表位(287-302)的免疫毒素,并鉴定其生物学功能。 方法: 通过基因工程方法将抗EGFR(287-302)的806单链抗体(806 single-chain antibody fragment, 806scFv )基因经柔性肽与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A, PEA)的截短形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET-22b-806scFv-PE38KDEL并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经纯化获得该免疫毒素融合蛋白806scFv-PE38KDEL,ELISA和流式细胞术检测其与EGFR的结合活性,间接免疫荧光检测重组免疫毒素的内化作用,CCK-8法检测806scFv-PE38KDEL对人脑胶质瘤细胞U87MG和U87MG-EGFRvⅢ、表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-MB-468、舌癌细胞CAL-27的细胞毒性。 结果: 成功构建重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL,诱导表达的蛋白806scFv-PE38KDEL以包涵体形式存在,经纯化后的纯度>95%,经SDS-PAGE和Western blotting 鉴定为目的蛋白。806scFv-PE38KDEL 能EGFRvⅢ胞外段蛋白结合,还能与外源性表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞和高表达EGFR的肿瘤细胞相结合,而与表达低水平EGFR的肿瘤细胞不结合。806scFv介导了重组免疫毒素的内化。806scFv-PE38KDEL对靶细胞有明显的杀伤作用,对过表达EGFRvⅢ的U87MG-EGFRvⅢ细胞IC50值为(5.85±0.03) ng/ml,对EGFR高表达细胞MDA-MB-468、A431、CAL-27的IC50值分别为(162.80±0.06)、(75.72±0.04)、(123.70±0.03) ng/ml。在1 μg/ml的质量浓度下,相比PBS对照组,806scFv-PE38KDEL对U87MG-EGFRvⅢ 、MDA-MB-468、A431和CAL-27细胞增殖的抑制率均显著增高\[(98.67±0.07)% vs (2.45±2.85)%、(86.26±101)% vs (0.48±1.76)%、(96.72±016)% vs (1.33±1.31)%、(96.29±0.30)% vs (2.00±0.60)%,均P<0.01\],而对U87MG细胞几乎没有抑制作用\[(359±2.09)% vs (0.19±0.95),P>0.05\]。 结论: 本研究所制备的靶向EGFR(287-302)表位的重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL能特异地结合并杀伤EGFRvⅢ或EGFR高表达的肿瘤细胞。 相似文献
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目的:制备抗EGFRvⅢ/EGFR单克隆抗体,并探讨其对人肝癌细胞株Huh7EGFRvⅢ和表皮癌细胞系A431裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:将稳转细胞株3T3 EGFRvⅢ免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,ELISA法筛选出EGFRvⅢ阳性的克隆株并命名为9B9。Western blotting和免疫荧光鉴定9B9抗体与EGFRvⅢ/EGFR抗原结合的特性。建立裸鼠人肝细胞癌和表皮细胞癌移植瘤模型,分别腹腔注射PBS、西妥昔单抗和9B9抗体,比较它们对各移植瘤模型的抑瘤效果。结果:通过杂交瘤制备单克隆抗体技术筛选获得一株单抗9B9,Western blotting和免疫荧光结果显示其既能识别EGFRvⅢ又能识别EGFR。9B9抗体和西妥昔单抗对人肝癌细胞Huh7EGFRvⅢ移植瘤的抑瘤率分别46%和42%,对人表皮细胞癌移植瘤的抑瘤率分别为86%和85%。结论:制备获得的单克隆抗体9B9可显著抑制裸鼠人肝细胞癌以及表皮细胞癌移植瘤的生长,具有与西妥昔单抗相似的抑瘤效果。 相似文献
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目的:制备抗EGFRvⅢ/EGFR单克隆抗体,并探讨其对人肝癌细胞株Huh7-EGFRvⅢ和表皮癌细胞系A431裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法:将稳转细胞株313-EGFRvⅢ免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,ELISA法筛选出EGFRvⅢ阳性的克隆株并命名为989.Western blotting和免疫荧光鉴定989抗体与EGFRvⅢ/EGFR抗原结合的特性.建立裸鼠人肝细胞癌和表皮细胞癌移植瘤模型,分别腹腔注射PBS、西妥昔单抗和989抗体,比较它们对各移植瘤模型的抑瘤效果.结果:通过杂交瘤制备单克隆抗体技术筛选获得一株单抗989,Western blotting和免疫荧光结果显示其既能识别EGFRvⅢ又能识别EGFR.989抗体和西妥昔单抗对人肝癌细胞Huh7-EGFRv Ⅲ植瘤的抑瘤率分别46%和42%,对人表皮细胞癌移植瘤的抑瘤率分别为86%和85%.结论:制备获得的单克隆抗体989可显著抑制裸鼠人肝细胞癌以及表皮细胞癌移植瘤的生长,具有与西妥昔单抗相似的抑瘤效果. 相似文献
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导入野生型p53基因对T细胞淋巴瘤化疗敏感性的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:探讨野生型p53基因对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞化疗敏感性的影响.方法:用脂质体介导法,将p53基因导入Jurkat细胞,经G418筛选获得p53稳定表达的细胞, 将细胞分别与0.1~100 μg/ mL 阿霉素(doxorubicin,ADM)或0.1~100 μg/mL足叶乙甙(etoposide, VP16) 培养24 h,采用MTT法检测细胞的生长抑制率.结果:转染p53基因的Jurkat细胞在0.47 μg/mL ADM和2.5 μg/mL VP16作用后,细胞生长抑制率为50%,与空载体转染组和未转染组比较,半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)明显降低(P<0.05).结论:p53基因能提高T细胞淋巴瘤Jurkat细胞对化疗药物ADM和VP16的敏感性, p53基因联合化疗药物可能成为耐药T细胞淋巴瘤治疗的新途径. 相似文献