人恶性畸胎瘤PA-1细胞染色体特性及其影响因素的探讨

目的:探讨人类恶性畸胎瘤PA-1细胞株染色体特性及其影响因素。方法:采用G带核型分析、DNA碱基序列分析及Western blot(蛋白印迹分析)等方法对经20余年407-445继代培养的PA-1细胞株染色体核型及p 53 基因状态进行了研究。结果:PA-1细胞株80%以上仍然保持近乎二倍体的核型,30代以后的细胞由于第15号染色体与20号染色体间的相互易位形成了M1及M2标识染色体。RT-PCR产物DNA定向序列分析显示具有野生及突变两个带(p53密码子239突变),Western blot 未检测出突变的p53基因蛋白,而p21蛋白的表达水平比正常成纤维细胞低。结论:人卵巢恶性畸胎瘤PA-1细胞株经20年的继代培养后,一个p53 等位基因发生错义突变,另一个仍然是野生型的。仅一个p53 等位基因发生突变,不足以引起细胞的染色体不稳定性。     

HCV非结构蛋白3真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3的构建

目的：构建HCV NS3基因真核表达载体，为进一步研究和解析HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制准备了条件。方法：将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒转化感受态菌JM109并扩增；提取pBRTM/HCV1-3011质粒；从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV NS3片段；并将其插入到克隆载体pMD18-T中，再与表达载体pcDNA3.1(-)重组，以得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3；最后限制性酶切鉴定HCV NS3表达载体。结果：从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV NS3片段大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/NS3内。结论：成功地构建了HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。     

反义寡核苷酸对Daudi细胞α2,6唾液酸的下调作用研究

 目的　研究反义寡核苷酸对Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞α2 ,6 唾液酸转移酶 (ST6GalI)的活性和细胞表面α2 ,6 唾液酸水平的下调作用。方法　以修饰后的ST6GalI的反义寡核苷酸处理Daudi细胞 ,以RT PCR检测Daudi细胞ST6GalImRNA的表达 ,荧光定量法测定ST6GalI的活性及以流式细胞仪检测细胞表面α2 ,6 唾液酸的含量。结果　和对照组比较 ,以反义寡核苷酸处理的Daudi细胞ST6GalImRNA的表达下调 ,ST6GalI酶活性下降 ,并导致细胞表面α2 ,6 唾液酸水平降低。结论　反义寡核苷酸可有效降低Daudi细胞表面α2 ,6 唾液酸化水平 ,内源性减少α2 ,6 唾液酸对Daudi细胞CD2 2受体的屏蔽作用     

结核杆菌Esat6与hGM-CSF双顺反子表达载体的构建及鉴定

目的 从质粒pVAE中克隆目的基因Esat6,与hGM-CSF一起构建双顺反子表达载体pIEG,并进行鉴定.方法 以质粒pVAE为模板扩增出Esat6基因,与pIRES的MCS A进行重组,构建pIEsat6重组质粒.然后再以pORF-hGM-CSF为模板扩增出hGM-CSF基因,与pIRES载体的MCS B进行重组,构建pIGM重组质粒,上述两重组质粒经PCR、限制性内切酶图谱及DNA序列测定分析等多种方法进行鉴定后,再通过酶切、连接把hGM-CSF构建于pIEsat6质粒中,形成双顺反子真核表达载体pIEG.结果 通过PCR可克隆得到相应大小的产物,酶切鉴定所切下的两片段大小约为0.29 kb和0.47 kb,与预计相符.测序结果与报道一致.结论 成功构建结核杆菌Esat6基因与hGM-CSF双顺反子真核表达载体,为进一步研究其结核融合DNA疫苗及其转染DC疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.     

细胞表面唾液酸及其连接方式对乳腺癌细胞黏附的影响

目的 研究肿瘤细胞总唾液酸及α2，6-连接唾液酸对乳腺癌细胞MDA-MB435黏附力的影响。方法 乳腺癌细胞MDA-MB-435转染顺义或反义α2，6唾液酸转移酶（ST6Ga1-I）cDNA，以黑接骨木凝集素SNA筛选高、低表达α2，6唾液酸细胞克隆．检测各转染细胞的同源凝集作用，并比较唾液酸酶处理前后肿瘤细胞对胶原Ⅳ黏附力的变化。结果 顺义转染克隆细胞．细胞之间的同源黏附能力下降．与胶原Ⅳ的黏附增强；反义转染克隆细胞-细胞之间同源黏附能力增强，而与胶原Ⅳ的黏附降低。唾液酸酶处理后肿瘤细胞与胶原Ⅳ的黏附力下降至未处理前的31％-57％。结论 乳腺癌MDA-MB435细胞表面唾液酸及α-2，6唾液酸化对肿瘤细胞的黏附有重要影响。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶抑制剂的研究进展

面对丙型肝炎的流行，至今缺少理想的治疗药物和方案，丙型肝炎病毒（HCV）的非结构蛋白3（NS3）蛋白酶是近年来抗丙型肝炎药物研究的重要靶点。作者综述了NS3蛋白酶抑制剂的作用机制和活性特点。     

稳定表达丙肝病毒EGFP-CORE融合蛋白细胞系的建立

目的：构建可表达丙型肝炎病毒（HCV）EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法：克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中，脂质体法转染QSG7701细胞后，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果：成功构建真核表达载体pEGFP-C1／CORE；建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论：重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE，为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。     

肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定

目的 应用分子生物学技术,构建pIG250-GM双顺反子真核表达质粒并进行测序鉴定.方法 从肾癌组织中提取总KNA,采用RT PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐荆hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIG250-GM真核表达质粒,并进行酶切鉴定.结果 酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.44kμ和0.47kμ,测序分析表明克隆的G250和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致.结论 成功构建双顺反子表达pIGM-G250质粒,为研究G250-GMCSF基因负载的DC疫苗防治肾癌提供了必要的实验基础.     

丙型肝炎病毒主要酶区结构及功能的研究进展

丙型肝炎病毒和黄病毒、瘟病毒同属于黄病毒科。实验研究证实HCV是一种单股、正链、RNA病毒,基因全长约为9．4kb。在HCV的核苷酸链中有一个巨大的开放读码框架结构(ORF),可编码一个含有3010或3011个氨基酸的多聚蛋白前体。此前体多聚蛋白在宿主细胞编码的信号肽酶作用下,裂解为衣壳蛋白C以及包膜蛋白E1和E2,其非结构蛋白部分在病毒编码的蛋白酶作用下可裂解为NSl、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NSSa和NS5b等7种蛋白。     

HCV-C蛋白抗原在人肝细胞株中的表达和鉴定

目的:构建HCV-C蛋白基因的真核表达载体,并在正常人肝细胞HL-7702中表达与鉴定。方法:从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM/HCV1-3011质粒中,扩增HCVcore基因片段,构建pcDNA3.1(-)/core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人正常肝细胞HL-7702,用免疫组化染色(SP)法检测HCVC蛋白的表达,并通过Westernblot进行鉴定。结果:所克隆的HCV-C基因片段的大小为573bp,序列正确。成功地构建了pcDNA3.1(-)/core重组表达质粒。以其转染HL-7702细胞后,用SP免疫组化染色法检测到了C蛋白的表达。Westernblot显示,其相对分子质量(Mr)约为21000。结论:构建的真核表达载体pcD-NA3.1(-)/core在人肝细胞中能有效表达HCV-C蛋白,为以后相应抗体的制备打下了基础。