人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的：克隆肿瘤特异性共享抗原mage-3基因，制备基于α－病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法：用RT-PCR方法从黑色素瘤细胞系LB373中制备mage-3基因，以含α－病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体，构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞，用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage-3蛋白的表达。结果：正确构建了mage-3/pSMART2a重组质粒，并且在转化此质粒的293细胞中检测出了mage-3蛋白的表达。结论：此重组mage-3/pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗，可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。     

慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达

目的分析慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达,初步探讨其分化表型。方法采集分离健康人和慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC),利用多种荧光标记抗体标记细胞表面分子,再用流式细胞仪检测CD8 和CD4 T淋巴细胞表面CD27和CD28分子的表达。结果31例慢性乙型病毒性肝炎患者CD8 CD27 CD28 T细胞占CD8 T细胞(41.13±24.89)%,低于28例健康对照组的(71.93±14.47)%(P<0.05)。而CD8 CD27-CD28-T细胞占CD8 T细胞(42.16±10.98)%,显著高于健康对照组的(9.16±5.24)%(P<0.01)。慢性乙型病毒性肝炎患者CD4 CD27 CD28 T细胞(80.89±7.93)%和健康对照组(83.17±8.31)%比较,差异无统计学意义。结论健康人外周血T淋巴细胞以CD27 CD28 早期分化表型为主。而慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中不同的亚群分化特征又有所不同,CD4 T淋巴细胞的分化表型仍然以CD27 CD28 早期分化表型为主,而CD8 T淋巴细胞中早期分化表型明显减少,晚期分化表型(CD27-CD28-)显著增加。     

多价精子抗原表位肽的设计与免疫效应研究

目的 开发可供两性使用的多价合成嵌合肽疫苗。方法 选择小鼠精子／睾丸特异性抗原SP17、Cyritestin中特异性氨基酸序列与牛核糖核酸酶非限制性T细胞表位作为骨架，按一定连接方式设计、合成新抗原35肽，并与弗氏佐剂混悬后免疫雌性BALB／C小鼠。结果 在430A固相自动肽合成仪上成功地合成35肽，并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95％以上；免疫后小鼠血清特异性IgG抗体滴度最高达1：6000，阴道粘膜冲洗液中特异性IgA抗体滴度最高达1：300；小鼠脾脏淋巴细胞增殖率达50％左右，淋巴细胞分泌的INF－γ和IL－4分别为60、108μg/ml；实验组BALB／c雌鼠妊娠率平均降至60％，每胎产仔数平均降低58％－71％。结论 含有两种特异性精子抗原中特异性氨基酸序列的新抗原可激发小鼠产生较理想的特异性体液免疫和粘膜免疫，并使小鼠受孕率下降，为研制适宜于两性的多价抗生育疫苗提供了实验基础。     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的CD28表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的CD28表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽五聚体（pentamer）技术结合流式多色分析技术，直接离体情况下（direct ex vivo）检测慢性乙型肝炎患者3个HLA-A2限制性的HBV表位特异性CTL表达CD28的情况。结果在22例HLA-A2^＋患者中，检测出HBcAg（18—27）特异性CTL有13例，频率为0．05％-0．16％；CD28^＋的HBcAg（18—27）特异性CTL的百分比为40％（23％-61％）。检测出HBeAg（335—343）有8例，频率为0.05％-0．24％；CD28%＋的HBeAg（335—343）特异性CTL的百分比为43％（36％-60％）。检测出HBp（575—583）特异性CTL有9例，频率为0．05％-0．19％；CD28^＋的HBpAg（575—583）特异性CTL的百分比为61％（45％-70％）。结论不同HBV抗原表位特异性CTL的CD28表达情况不同。     

α-病毒载体在基因治疗中的作用

基因治疗是近10年来随着现代医学与分子生物学相结合而出现的，基因治疗的研究已迅速扩大到肿瘤、艾滋病、心血管病和神经系统疾病等。而且，基因载体(包括质粒、病毒和脂质体等)的研究也进展迅速，各种新型载体不断出现。近10年来，α-病毒的多个成员已经被作为表达载体，并被引入基因治疗领域，其中最常用的是森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、     

抗原致敏期缺损补体增强抗肿瘤免疫效应

目的 观察蛇毒因子(CVF)缺损补体对疫苗诱导的抗肿瘤免疫的影响.方法 用CVF分别在抗原的致敏期和免疫的效应期缺损补体,抗原OVA加完全弗氏佐剂(CFA)联合免疫C57BL/6小鼠,14 d后接种E.G7肿瘤细胞,评价补体缺损效果,观察肿瘤出现时间,记录小鼠肿瘤大小.结果 OVA CFA免疫的正常小鼠,在肿瘤接种14 d内能完全抑制肿瘤生长;抗原致敏期缺损补体,肿瘤接种21 d内能完全抑制肿瘤生长;免疫效应期缺损补体,肿瘤出现的时间与OVA CFA免疫的正常小鼠相似.结论 抗原致敏期补体缺损可能有利于抗肿瘤免疫.     

CT抗原KM-HN-1 HLA-A * 0201限制性表位预测及其与HLA-A * 0201结合强度分析

目的通过对CT抗原（cancer-testis antigen）KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，并对候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合亲和力及复合物稳定性进行分析，为探索基于KM-HN-1的免疫治疗奠定基础。方法利用基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法PAProc及基于肽MHC-I结合的算法BIMAS和SYFPEITHI对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测．合成KM-HN-1相关候选表位肽KM-HN-I321-329（KLLPFRETV），KM-HN-I303-211，（FLPTAPPNV），KM-HN-I629-637。（TLLQIIETV），KM-HN-I87-95（ILNKSIIEV），KM-HN-I538-596。（QMMEALDQL）及阳性对照肽HBVcAg18-27（FLPSDFFPSV）；对这些合成肽与HIA-A＊0201分子结合亲和力及其复合物稳定性根据文献报道的方法进行分析。结果KM-HN-I321-329（KLLPERETV）结合亲和力最低，KM-HN—I203-211（FLPTAPPNV）结合亲和力最高，其余3条肽结合亲和力介于2者之间；稳定性实验（DC50）结果显示：KM-HN-I538—546（QMMEALDQL）DC50小于2h，KM—HN-I321-329（KLLPERETV）的DC50介于2～4h之间，KM-HN-I87-95。（ILNKSIIEV）的DC50介于6～8h之间，KM-HN-I233-211（HLPTAPPNV）及KM-HN-I629—633（TLLQIIETV）的DC50均大于8h。结论基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法及基于肽MHC-I结合的算法对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，结合候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合的亲和力与复合物稳定性实验分析，为该抗原HLA-A＊0201限制性表位的鉴定奠定了基础。     

肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶

目的 蛋白质组学分析鉴定与肿瘤细胞共培养T细胞的表达差异蛋白.方法 双向电泳分离有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白,PDQuest软件分析筛选肿瘤细胞诱导表达异常的蛋白点,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MAL-DI-TOF MS)对酶解消化样品进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,结合数据库搜索鉴定蛋白质.结果 PDQuest分析有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白双向电泳图谱,70余个蛋白点表达水平差异显著,其中与肿瘤细胞共培养的T细胞有一明显表达下调的蛋白点,质谱分析结合数据库检索表明该蛋白点为腺苷脱氨酶.结论 肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶.     

慢性乙型肝炎患者外周血T细胞KIR表达研究

目的：检测慢性乙型肝炎患者外周血T细胞表面KIR的表达情况。方法：采用三色流式细胞术检测慢性乙型肝炎患者外周血CD4^＋T细胞和CD8^high T细胞表面KIR分子表达，并与正常外周血比较。结果：慢性乙型肝炎患者外周血中CD8^high T细胞KIR表达明显高于对照组CD8^high T细胞。正常外周血CD4^＋T细胞几乎不表达KIR，慢性乙型肝炎患者外周血中CD4^＋T细胞表达KIR。结论：慢性乙型肝炎患者T细胞表面KIR表达明显增加。     

鼠源轮状病毒vp7基因的表达载体构建及转基因植物的研究

目的：构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp7的植物表达载体及植物转化研究。方法：抗原基因vp7经PCR扩增后直接克隆到PUC－T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果：以重组农杆菌为介导将靶基因转入到马铃薯外植体。成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中；以农杆菌为介导获得抗性转基因马铃薯植株。结论：通过PCR检测，初步确定轮状病毒外壳蛋白基因vp7已成功地整合到马铃薯植株中。