小鼠PD-L1胞外段基因的原核表达及活性分析

目的原核表达小鼠程序性死亡分子1配体胞外段(exPD-L1)蛋白基因并在体外初步验证其生物学活性。方法应用小鼠脾脏细胞总RNA,反转录PCR克隆exPD-L1基因序列,将其克隆到pGEX-4T-1载体中构建原核表达载体pGEX-4T-1-exPD-L1,经酶切和测序鉴定正确后,转化到E.coli BL21(D3)中,经IPTG诱导表达后,对包涵体蛋白进行复性和纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot法检测证明其正确后,采用GST pull-down检测融合蛋白和PD-1的相互作用,鉴定其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-exPD-L1,并在宿主菌中成功表达相对分子质量(Mr)55 000的重组蛋白,包涵体成功复性和纯化后经Western blot法证明其正确表达,同程序性死亡分子1(PD-1)蛋白的GST pull-down结果表明融合蛋白具有生物学活性。结论成功克隆和表达小鼠exPD-L1蛋白,并证明其具有生物学活性。     

DO11.10转基因小鼠脊髓损伤后的运动功能恢复

目的:通过比较两种小鼠-DO11.10和BALB/c小鼠脊髓损伤后不同的运动功能恢复程度和损伤区的形态学变化来分析T淋巴细胞对脊髓损伤修复的影响。方法:建立小鼠脊髓重度夹伤模型,HE染色,GFAP、CD11b和淋巴细胞免疫组织化学实验分析损伤14 d、21 d后损伤区的变化;在损伤后0 d、7 d、14 d和21 d进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动评分来评价小鼠运动功能恢复情况。结果:脊髓损伤后21 d,BALB/c小鼠产生了较厚的胶质瘢痕并伴有明显的固缩现象;而DO11.10小鼠中只观察到稀薄的胶质瘢痕形成并没出现明显的固缩。DO11.10小鼠脊髓损伤后14 d,巨噬/小胶质细胞浸润较BALB/c小鼠明显增加。脊髓损伤后21 d,DO11.10小鼠脊髓损伤区中的T淋巴细胞较BALB/c小鼠明显减少。BBB运动评分显示,在损伤后21 d内DO11.10小鼠较BALB/c小鼠有显著的运动功能恢复。结论:脊髓损伤后21 d内,针对神经组织抗原的自身反应性T淋巴细胞的浸润和存在不利于脊髓损伤后的运动功能恢复。     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.     

醛糖还原酶通过cAMP反应元件结合蛋白通路调控小胶质细胞向M2型极化

目的探讨醛糖还原酶(AR)调控小胶质细胞极化的机制。方法体外培养BV2小胶质细胞,给予醛糖还原酶抑制剂(ARI),通过免疫组织化学染色和酶标仪检测荧光强度的方法检测细胞4-羟基反式-2-壬烯酸(HNE)表达;体外培养N9小胶质细胞,分别用脂多糖(LPS)、HNE、醛糖还原酶抑制剂fidarestat(ARI)及其组合刺激后,利用Western blot法检测在不同刺激条件下N9细胞调控细胞极化和极化相关蛋白的变化;在上述刺激的条件下,联合应用cAMP反应元件结合蛋白(CREB)抑制剂KG-501,利用Western blot法检测极化相关蛋白的变化。结果阻断AR后使HNE在BV2细胞内堆积;Western blot法检测发现ARI通过增加磷酸化CREB的表达来调控N9细胞向M2型极化;应用CREB抑制剂后,能阻断上述过程。结论阻断AR可以使CREB的表达上调进而促进小胶质细胞向M2型极化。     

PB-GF转座子系统的构建及其在真核细胞中转座的研究

目的构建能在真核细胞中发生转座的PB-GF(piggyBac gene-finder)转座子系统,作为发现和研究编码基因的工具。方法通过克隆技术,构建PB转座子载体pPB[CMV-neo]和PB转座酶表达载体pCAG-PBase,转染HeLa细胞,G418筛选和亚甲基蓝染色,验证PB转座酶在真核细胞中的转座能力。构建PB转座子载体pPB[β-Gal-pA/act-EGFP],使其包含两侧翼端加入PB转座酶识别位点反向末端重复序列(ITR),ITR1和ITR2,以及启动子陷阱和PolyA陷阱的DNA片段;同时与PB转座酶表达载体pCAG-PBase一起,构成PB-GF转座子系统。将PB-GF转座子系统转染HeLa细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测PolyA陷阱报告基因EGFP的表达;通过X-gal染色,观察启动子陷阱报告基因β-Gal的表达,明确PB-GF转座酶系统在真核细胞中的转座情况。结果成功构建成以转座子PiggyBac为基础的,含有启动子和PolyA陷阱的PB-GF转座子系统,并用该系统转染HeLa细胞24 h后观察到有相当数量的EGFP和LacZ阳性的细胞出现,转座效率高达26%。结论成功构建PB-GF转座子系统并可以在真核细胞中发生转座。     

PD-L1转基因小鼠的建立及其脊髓损伤后的运动功能恢复

目的:建立广泛表达PD-L1的转基因小鼠,并且评价转基因小鼠脊髓损伤后的运动功能恢复情况。方法:克隆小鼠PD-L1基因编码区的cDNA,经测序正确后,将PD-L1基因cDNA插入到pCAGGS质粒中,构建pCAG-PD-L1转基因载体;经C57BL/6小鼠受精卵原核注射,建立PD-L1转基因小鼠;PCR鉴定转基因小鼠的基因型;以流式细胞术(FCM)检测转基因小鼠脾脏中T、B淋巴细胞PD-L1的表达情况;免疫组织化学检测转基因小鼠周围组织PD-L1表达情况;RT-PCR检测转基因小鼠神经组织内PD-L1表达;BBB评价转基因小鼠脊髓损伤后运动功能恢复。结果:获得PD-L1转基因小鼠,外源PD-L1基因可以顺利遗传给子代;免疫组织化学、RT-PCR和FCM发现:PD-L1转基因小鼠的神经组织、淋巴组织以及生殖器官中高表达PD-L1;PD-L1转基因小鼠脊髓重度夹伤后,其BBB运动学评分明显高于野生型小鼠(P<0.05)。结论:成功地建立了C57BL/6背景的PD-L1转基因小鼠,且PD-L1基因的高表达促进脊髓损伤后的运动功能恢复。     

小鼠脊髓损伤早期不同炎症因子的表达变化

目的:探讨小鼠脊髓夹伤后早期各时间点损伤区中IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)、IL-4、IL-10、TGF-β的表达变化情况。方法:6 8周雄性BALB/c小鼠行T8节段脊髓重度夹伤模型,分别于术后6 h、12 h、24 h、3 d和7 d取以损伤区为中心共5 mm脊髓,用TRIzol试剂提取总RNA,反转录后进行实时定量PCR检测上述各基因的表达情况。结果:小鼠脊髓损伤早期,损伤区促炎因子IL-1β、IL-6及趋化因子MCP-1、MIP-1急剧升高,6 h内即达高峰,随后开始下降,3 d内归于正常;而炎症抑制因子IL-4早期不升反降,3 d降至最低;IL-10在6 h有所升高,但无统计学意义;TGF-β逐渐升高,12 h至高峰,随后下降,7 d再度升高。结论:脊髓损伤早期损伤区促炎因子表达增加,炎症抑制因子表达不变或减少,可能使损伤局部的炎症反应呈扩大趋势,从而导致继发的炎症损伤。     

醛糖还原酶在小鼠损伤脊髓小胶质/巨噬细胞中的表达及其作用

目的:观察小鼠在脊髓损伤(SCI)后,醛糖还原酶(AR)在脊髓损伤后修复过程中的作用及可能的机制。方法:采用C57BL/6-ar+/+(B6野生型小鼠)和C57BL/6-ar-/-(B6-AR基因敲除)小鼠,建立脊髓重度夹伤模型。首先分析了AR分子在损伤脊髓中的细胞表达类型及脊髓损伤后AR分子mRNA的表达水平变化情况;通过BBB运动学分析,比较AR基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓损伤后运动功能恢复情况,对比损伤区面积变化;通过qRT-PCR方法,检测对比M1/M2型巨噬细胞特异分子iNOS和Arg I的表达变化。结果:AR分子在野生型小鼠损伤脊髓中的小胶质/巨噬细胞中高表达;qRT-PCR研究发现:脊髓损伤后AR表达逐渐升高,在损伤后第3天达到高峰。AR敲除小鼠在脊髓损伤后,其运动功能恢复好于野生型小鼠(P<0.05),同时损伤区面积也小于对照组。AR基因缺失后,损伤脊髓中的小胶质/巨噬细胞通过高表达Arg I向M2型巨噬细胞方向极化。结论:AR通过调节脊髓中小胶质/巨噬细胞的极化来影响脊髓损伤后的修复。     

六种抗大鼠Nogo-A分子单克隆抗体的免疫荧光组织化学染色特性的比较

目的:检测和比较6种针对大鼠Nogo-A分子不同表位的单克隆抗体(mAb)应用于中枢神经组织的免疫组化染色特性,从而决定它们今后可能的应用范围和方法。其中4种mAb是针对Nogo-A分子中Nogo66片段,分别命名为No-go66-1、Nogo66-2、Nogo66-3和Nogo66-4;其他2种mAb是针对Nogo-A分子氨基端(570-691)肽段,分别为Nogo-N1和Nogo-N2。方法:利用免疫荧光组织化学,检测Nogo-A mAb抗体对大鼠神经组织的反应性与特异性。结果:正常SD大鼠脊髓组织的免疫荧光组织化学双标结果显示,制备的6种抗大鼠Nogo-A分子mAb均可以与商品化的兔抗大鼠Nogo-A多克隆抗体(PcAb)双标记;其中Nogo66-1、Nogo66-2、No-go66-4和NogoN-2 mAb可与MBP阳性细胞双标记,与GFAP阳性细胞不共存;而Nogo66-3和NogoN-1 mAb不仅可以与MBP阳性细胞双标,同时也可以和GFAP阳性细胞共存。结论:Nogo66-1、Nogo66-2、Nogo66-4和NogoN-2 mAb可很好的识别组织中的Nogo-A分子,用于免疫组化研究。     

神经干细胞移植治疗脊髓损伤的临床研究现状及存在的问题

正脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是由于外伤、肿瘤、炎症和缺血缺氧等原因引起的脊髓损害,导致SCI患者损伤平面以下功能永久性障碍,严重影响患者的生活质量,并给患者家庭和社会带来沉重经济负担,目前尚无有效治疗方法,已成为全球性的研究重点和难题。